MAPK信号通路及内质网应激对心肌缺血再灌注损伤的影响

杨天睿，叶 堃，苗云波，段靳岚，杨起江，张思思

(1.云南省第一人民医院 老年病科，云南 昆明 650032； 2.昆明理工大学附属医院，云南 昆明 650032；3.昆明理工大学 医学院，云南 昆明 650500)

0 引 言

据国家心血管病中心发布的《中国心血管病报告2019》数据显示，我国心血管病现患病人数为2.9亿，每年我国约有350万人死于心血管病，占总死亡病因的41%，居各种疾病之首.1990-2017年，中国人群缺血性心脏病(ischemic heart disease，IHD)疾病负担及其危险因素的变化趋势分析中显示，IHD 伤残调整寿命年(DALY)率由1990年 1 116.4/10万增至2017年 2 131.0/10万，增长率为90.9%；且≥70岁人群伤残寿命损失年(YLD)率的2007-2017年均增长率(0.4%)高于1990-2007年均增长率(0.2%)，证明了虽然IHD所致的过早死亡得到了有效控制，但其所致伤残负担增大，成为疾病负担的主要来源[1].目前针对缺血性心脏病主要治疗手段包括冠状动脉旁路移植术、经皮冠状动脉介入、药物等，治疗机制均是通过快速恢复心肌血流灌注，从而减轻心肌损伤甚至心肌坏死.然而，在心肌缺血恢复的同时，即可激发因再灌注导致细胞功能受损，即缺血再灌注损伤(Ischemia Reperfusion Injury, I/R)[2].已有研究表明[3]，在心肌细胞发生缺血再灌注损伤后常伴随着细胞凋亡的增加，但尚缺乏从丝裂原活化蛋白激酶通路(Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK)及内质网应激等方面入手，分析其在细胞凋亡与心肌缺血再灌注损伤过程中的病理生理机制.

为此，本研究关注于心肌缺血再灌注后细胞凋亡率及其包括凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2，Bcl-2), Bax蛋白，磷酸化的P38蛋白，磷酸化应激活化蛋白激酶-1(p-c-Jun N-terminal kinase-1，P-JNK-1), 磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p-extracellular regulated protein kinases，P-ERK)，葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78kD，GRP78), 内质网应激相关蛋白，即C/EBP同源蛋白(C/EBP-Homologous Protein，CHOP)在内的蛋白表达水平的变化.

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年雄性实验树鼩滇西亚种40只，4～6月龄，体重120～150 g，由中国医学科学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心提供，合格证 SCXK(滇)K2015-0002.本研究经本院伦理委员会审核通过，编号(2017)伦审【科】第(025)号.

1.2 试剂及主要仪器

全蛋白提取试剂盒(Wanleibio)，TUNNEL细胞凋亡检测试剂盒，TUNNEL检测液，Western洗涤液(wanleibio)，PVDF膜(Millipore)，Anti-Bcl-2抗体[E17](Abcam)，Anti-Bax抗体[E63](Abcam)，Anti-CHOP抗体[9C8](Abcam)，Anti-GRP78 BiP抗体(Abcam)，Anti-ERK1抗体[Y72](Abcam)，Anti-ERK1 (phospho Y204)抗体(Abcam)，Anti-JNK1抗体[EPR140(2)](Abcam)，Anti-p38抗体[E229](Abcam)，山羊Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)(Abcam)，Anti-beta Actin抗体[mAbcam 8226](Abcam).PowerLab型Langendorff离体心脏灌流系统，DYY-7C型电泳仪，DYCZ-24DN型双垂直蛋白电泳仪，WD-9413B型凝胶成像系统，石蜡切片机，荧光显微镜.

1.3 实验方法

健康成年雄性实验树鼩滇西亚种40只，随机分为持续灌注对照组(一组)、缺血模型组(二组)、缺血再灌注模型组(三组)，共3组，保证每组试验成功10只.建模方法和标准参考文献[4]，用3.6%的水合氯醛腹腔麻醉给药(1 mL/只)，经腹腔肝素化(普通肝素 1 000 U/只)抗凝.迅速开胸将心脏分离，并移至Langendorff灌注装置上，逆行插管主动脉，用K-H液恒温(37 ℃)恒压(60 mmHg,1 mm Hg=0.133 kPa)稳定灌注，保证冠状动脉回流通畅，冠脉流量为6～12 mL/min.待灌注系统稳定后，空白对照组持续灌注 60 min，缺血组持续灌注 30 min 后停灌 30 min，缺血再灌注组稳定灌注后停灌 30 min，再灌注 30 min.

1.4 标本采集

待灌注结束，立即取下心脏，冲去血渍，用滤纸吸干水分，将心脏置于 -20 ℃ 冷冻 2 h 后，沿心脏冠状面以 2 mm 间隔切出6片心肌，之后将心室肌组织分割成 0.2 g 大小的组织块.

1.5 TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数

按试剂盒说明书操作(每张切片上，随机抽取凋亡的细胞核高倍视野必须达5个以上，并且心肌细胞核数不得少于200个).

凋亡指数(Apoptotic Index)=阳性细胞/(阳性细胞+阴性细胞)×100%

通过切片包埋，切片脱蜡到水，染色，抗荧光淬灭后封片，在荧光显微镜下进行观察(波长为 570 nm，红色荧光)，于200×镜下拍照并计数凋亡率.

1.6 Western-blot法检测

将心室肌组织块放入 5 mL 的小烧杯中，与预冷的匀浆介质1∶9配比，剪碎后倒入玻璃匀浆器中研磨成10%的心肌均浆，按照蛋白提取试剂盒说明书提取树鼩心肌组织蛋白，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒，完成样品蛋白浓度测定.以 20 μL/孔上样进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后迅速将蛋白转膜至PVDF 膜，封闭后的PVDF膜用TBST 漂洗5 次后，分别加入稀释一抗和二抗 ( TBST 1∶5 000 稀释)，室温孵育及漂洗后将ECL化学发光试剂A、B等体积混合，凝胶成像仪下显影成像.用Image J图象处理软件分析目的条带，以目的条带与β-actin条带之比进行半定量分析.

1.7 统计学分析

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析.符合正态分布的计量资料表示以均数±标准差表示，使用单因素方差分析方法比较各组间的计量资料；多重比较使用方差齐性时采用LSD方法，方差不齐时采用Dunnett-t检验分析方法，以P<0.05表示有统计学意义.

表1 凋亡率比较(x±s)

图1 凋亡率比较Fig.1 Comparison of apoptosis rate

2 结 果

2.1 Tunnel凋亡率组间比较

由表1及图1可见，Tunnel凋亡率两两比较发现缺血模型组显著高于对照组，再灌注模型组显著高于对照组、缺血模型组,且均具有统计学意义，即再灌注模型组呈现大量的凋亡细胞，tunel染色呈阳性，而缺血模型组次之，对照组发生凋亡的细胞则最少.

2.2 凋亡蛋白 Bcl-2与BAX组间表达量比较

由表2及图2可知，凋亡蛋白BCL-2蛋白表达量:空白对照组>缺血模型组>再灌注模型组；Bax蛋白表达量:空白对照组<缺血模型组<再灌注模型组；再灌注模型组Bcl-2/Bax比值下降明显.

表2 Bcl-2与Bax表达量比较(x±s, n=10)

图2 Bcl-2与Bax表达量比较Fig.2 Comparison of expression in Bcl-2 and Bax

2.3 P38、JNK-1、ERK组间表达量比较

图3 P38、JNK-1、ERK表达量比较Fig.3 Comparison of expression in Lin P38, JNK-1, ERK

由表3可知，心肌组织P38、JNK-1、ERK磷酸化水平两两比较，发现缺血再灌注模型组显著高于缺血模型组，缺血模型组显著高于空白对照组.由图3可知，从空白对照组、缺血模型组至缺血再灌注模型组，磷酸化P38、JNK-1、ERK蛋白量均呈现逐渐增高表达趋势.

表3 心肌组织P38、JNK、ERK表达量比较(x±s)

图4 GRP78、CHOP-1表达量比较Fig.4 Comparison of expression in GRP78 and CHOP-1

2.4 GRP78、CHOP-1组间表达量比较

由表4及图4可见，心肌组织GRP78、CHOP-1表达量水平：空白对照组<缺血模型组<缺血再灌注模型组，且各组GRP78、CHOP-1蛋白量表达呈现逐渐增高趋势.

表4 心肌组织GRP78、CHOP-1表达量比较(x±s)

3 讨 论

本研究采用动物离体心脏模型模拟缺血再灌注损伤过程，挖掘心肌缺血再灌注损伤的病理生理机制.细胞凋亡是通过激活信号通路，启动细胞内死亡蛋白系统，诱导细胞发生程序化死亡.研究发现细胞凋亡参与了缺血再灌注损伤过程始终，并受多种基因调控，与Bcl-2家族密切相关[5].研究证实[6-7]，Bcl-2/Bax比值直接影响着细胞存亡，Bcl-2/Bax值增加，细胞趋于存活；比值下降，细胞趋于凋亡.当心肌缺血再灌注发生时，Bax基因表达显著上调，Bcl-2基因表达显著下调.MAPK家族是细胞内重要的信息传递系统，正常情况下这类激酶分布于细胞质中，以弱活化状态或静止状态存在，当细胞受到刺激，该系统往往被激活，通过磷酸化作用，进而调节下游分子底物的生物学活性，介导包括细胞凋亡等多种细胞的病理生理过程[8].当细胞处于缺血再灌注损伤状态，MAPK应急信号通路p38信号途径迅速启动，增强了胞质蛋白质和转录因子的磷酸化水平，加重细胞凋亡.JNK作为MAPK家族的重要信号通路，在I/R损伤发生时，其通过介导线粒体释放促凋亡因子，直接促进Bcl-2高表达，诱导促炎细胞因子大量表达[9-10]，与细胞调亡有着密切联系.大量研究表明[11]，ERK信号通路参与调节多种细胞生理功能，虽然不同的实验模型中，ERK作用可能存在差异，但ERK对细胞存活或损伤发挥着重要作用.ERK往往在心损早期参与启动细胞内源性保护机制，而在长时间I/R过程中，其作用则为介导细胞损伤[12].内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress，ERS)发生时[13]，应激性蛋白分泌增加，激活促凋亡编码基因，其中GRP78蛋白作为内质网应激的标志性蛋白，在维持内质网稳态中扮演着重要角色[14].当细胞受到缺氧、缺血等有害刺激时，GRP78蛋白则大量表达，调控细胞信号传导，减少内质网上尚未折叠或错误折叠蛋白的积累，维持钙离子平衡，保持细胞内环境稳定，尽可能延长处于有害要素刺激下的细胞存活期[15].GRP78下游的信号分子CHOP是增强子结合蛋白同源蛋白，为特异性转录因子，其作用机制主要是启动胱天蛋白酶级联反应，从而参与到细胞凋亡过程中[16].

本研究发现，与空白对照组及缺血模型组相比较，缺血再灌注模型组细胞凋亡率明显升高，再灌注模型组Bcl-2蛋白相对表达量较对照组显著下调，Bax表达量明显增加，其Bcl-2/Bax比值下降，细胞趋于凋亡，以上结果与之前研究相一致，再次证明了细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤的重要环节.在缺血再灌注模型组中磷酸化P38、JNK、ERK蛋白表达量均显著增加，激活了MAPK家族信号通路系统，将信息传导至细胞核内，调控多种转录因子表达，最终诱导细胞凋亡.GRP78、CHOP-1蛋白表达量显著增高，可能启动了细胞内质网应激的发生，削弱了细胞的自我保护作用，加重了细胞凋亡.本实验结果证实在心肌缺血再灌注损伤发生及其发展过程中，细胞通过启动MAPK信号通路、激活内质网应激系统，调控相关蛋白表达，加速细胞凋亡.

但本研究也存在一定的局限性，样本量相对较小，尚缺乏临床研究数据等.细胞凋亡贯穿于缺血再灌注损伤过程中，但因其涉及诸多环节，并存在交互作用，要从机制根源阻止损害发生，今后的工作将任重而道远.

4 结 论

本研究运用离体心肌缺血再灌注模型，避免神经体液因素的干扰，直接显现心肌缺血再灌注损伤过程，首次以实验树鼩作为实验动物，在生物医药研究方面具有重要价值.细胞凋亡是缺血再灌注损伤机制中关键环节，MAPK家族是细胞内的重要信息传递系统，研究发现，在缺血再灌注损伤中心肌细胞通过活化P38 MAPK信号通路表达，激活JNK信号通路，调节ERK信号通路水平，引起细胞凋亡.细胞内质网功能障碍是心肌缺血再灌注损伤的重要原因，研究证实缺血再灌注损伤活化了内质网分子伴侣GRP78和特异性促凋亡分子CHOP，心肌细胞出现过度的ERS，内质网稳态失调，加重线粒体损伤.该研究将细胞凋亡、细胞信号传导、细胞器功能损害有机联系起来，展现了一系列细胞效应过程，深入挖掘心肌缺血再灌注损伤机制，为下一步的干预研究奠定基础.