杉木ATP合酶基因的克隆及其在逆境下的表达分析

汪佳琪，戴嘉豪，陈家琛，林莉莉，曹光球，曹世江*

（1.福建农林大学 林学院，福建 福州 350002；2.林木逆境生理生态及分子生物学福建省高校重点实验室，福建 福州 350002；3.国家林业和草原杉木工程技术研究中心，福建 福州 350002；4.华川技术有限公司，福建 福州 350008）

【研究意义】林木在生长过程中可能会遭受高温、干旱、低温等各种类型的逆境，随着逆境胁迫的程度加强，植物会从外形、生理甚至分子水平作出一系列应答反应[1]，为适应或抵御这些恶劣环境，植物会形成一套复杂的基因表达调控机制，从而提高自身的抗逆境能力[2]。杉木（Cunninghamia lanceolata）是我国人工造林面积最大的用材树种，广泛分布于南方各个省份。杉木因具有较高的经济、社会效益，速生且材质坚韧轻盈等特点而广泛应用于家具和建筑等行业[3-4]。近年来，由于住宅产业化的发展以及人们生活品质的提高，消费者的个性化需求增加，杉木行业需要不断发展才能满足市场需求[5]，可由于近年来人类的活动以及气候的变化，我国的土壤盐渍化情况加剧，干旱面积越来越大[6]，逆境胁迫成为影响杉木生长发育的重要限制因素，这将严重降低杉木人工林的产量，并对杉木人工林高效培育事业产生十分不利的影响[7]。因此，提高杉木抵抗逆境胁迫的能力和选育抗逆性强的杉木种质资源对实现杉木速生丰产具有重要意义。

【前人研究进展】目前已有很多学者从分子水平上对植物逆境胁迫下的响应机制进行了深入的探究[8]。有研究人员发现，植物在逆境胁迫下的基因表达调控机制和能量的代谢关系密切[9]，受胁迫的植物会大量消耗ATP 从而产生活性氧，限制植物生长。张罗沙等[10]的研究表明紫丁香根系中质膜ATP 酶活性的强弱与紫丁香的耐盐碱性有关。【本研究切入点】张静等[11]发现ATPase-E基因表达量的增加使高粱的耐干旱、耐盐能力均有所提高。然而目前，关于ATP合酶亚基基因在杉木抵抗逆境胁迫所起到的作用的研究报道较少。【拟解决的关键问题】研究克隆杉木ClF0F1-ATP基因，分析了其生物信息学特征，并且通过实时荧光定量PCR技术探究该基因在不同逆境胁迫的表达情况，为解析杉木ClF0F1-ATP基因在逆境胁迫下的响应机制提供理论依据，以期为进一步探究杉木的抗逆境能力奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

研究所用第三代杉木种子由福建省洋口国有林场提供，将饱满的杉木种子播于培养皿后，置于昼/夜=12 h/12 h，25 ℃（昼）/20 ℃（夜），湿度75%的光照培养箱中培养。

1.2 试验方法

1.2.1 材料处理 干旱胁迫：种子萌发14 d 后，分别将配置好的5%（质量分数，下同）PEG 溶液和25%PEG 溶液加入培养皿中，进行低强度和高强度干旱胁迫处理，于6，12，24，48 h 分别取种子萌发芽用于后续分析。盐胁迫：种子萌发14 d 后，分别将配置好的50 mmol/L Nacl 溶液和250 mmol/L Nacl 溶液加入培养皿中，进行低盐和高盐胁迫处理，处理6，12，24，48 h 分别取种子萌发芽用于后续分析。温度胁迫：种子萌发14 d 后，将其置于对4 ℃低温和35 ℃高温环境中，培养6，12，24，48 h 分别取种子萌发芽用于后续分析。

1.2.2 杉木总RNA 的提取与cDNA 的合成 以杉木种子萌发芽为实验材料，采用Trizol法提取杉木种子萌发芽总RNA，利用1%（质量分数）琼脂糖凝胶电泳检测总RNA 完整性。使用Invitrogen 逆转录试剂盒（SuperScript IV）进行反转录合成cDNA用于基因克隆和表达分析。

1.2.3 PCR 扩增 利用前期实验所得的杉木转录组数据（未发表数据），利用Gateway 技术设计特异 引物，所用引物序列：ClF0F1-ATP-Fw：5′-ATGCTGGGCCGTCAGGCACT-3′；ClF0F1-ATP-Rv：5′-TCCTGTGAGAGCCGAATTTAATG-3′；将得到的cDNA 作为模板进行聚合酶链式反应（PCR）。反应程序为：94 ℃2 min；98 ℃10 s，55 ℃30 s，68 ℃1 min，68 ℃7 min。电泳检测后将PCR 扩增产物回收纯化，连接至pENTR 载体后转入大肠杆菌DH5α，菌落PCR 筛选阳性菌落提取质粒，最后由铂尚生物公司进行测序。

1.2.4 生物信息学分析 分别采用在线工具ProtParam、Protscale、SWISS-MODEL 在线软件、Blast 工具、MEGA6.0 软件以及MEME Suite，对ClF0F1-ATP 蛋白分别进行理化性质分析、亲疏水性分析，三级结构的预测、同源序列的比对分析、氨基酸序列系统进化树的构建以及保守序列的分析。

1.2.5 亚细胞定位 回收PCR扩增产物，利用Gateway系统构建克隆载体pENTR-ClF0F1-ATP，随后重组至植物表达载体pGWB-35S-GFP后转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性菌落提取质粒，最终获得载体pGWB-35S-ClF0F1-ATP-GFP。将最终构建的载体质粒进行电转至农杆菌GV3101，在28 ℃环境培养2～3 d后接菌于YEB液体培养基，经离心取上清液，调OD600至0.8，注射在烟草叶片下表皮，25 ℃培养2 d，用激光共聚焦显微镜观察并记录[12]。

1.2.6 荧光定量表达分析 分别提取不同胁迫处理后的杉木种子萌发芽的总RNA，反转录合成cDNA后进行实时荧光定量PCR，内参基因为Actin，采用2-△△CT法处理数据[13]。

2 结果与分析

2.1 ClF0F1-ATP基因的克隆分析

由图1所示，以杉木种子萌发芽cDNA 为模板，经PCR 扩增后获得的一条单一的目的条带，大小约为600 bp，与预期结果吻合，经铂尚生物公司测得该序列全长618 bp，编码205个氨基酸。鉴于大量研究发现，ATP合酶中的F形态结构都是由亲水的球状F1嵌入疏水的F0并通过中心转轴和外围柄连接而成[14]，由此命名克隆得到的ATP合酶基因为ClF0F1-ATP。

图1 ClF0F1-ATP基因PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification product of ClF0F1-ATP gene

2.2 ClF0F1-ATP蛋白的理化性质分析

由ExPASy 系统中的ProtParam 工具对杉木ClF0F1-ATP蛋白分析结果显示，该蛋白的化学分子式为C983H1561N259O291S6，相对分子量为21 856.13 Da，由19 种共计205 个氨基酸组成，理论等电点为6.20，总原子数为3 100。该蛋白中的谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）带负电荷20个，精氨酸（Arg）和赖氨酸（Lys）带正电荷18 个。不稳定系数值37.16，说明ClF0F1-ATP 蛋白理化性质稳定。其脂肪系数为90.44，总平均亲水性为0.049。由ExPASy 中的Protscale 工具分析显示杉木ClF0F1-ATP 蛋白属于疏水性蛋白，其疏水性和亲水性最高值分别为1.057和-1.038（图2）。

图2 ClF0F1-ATP蛋白疏水性Fig.2 Prediction hydrophilicity map encoded by ClF0F1-ATP protein

2.3 ClF0F1-ATP蛋白的三级结构预测

ClF0F1-ATP 蛋白模型的构建以及其三级结构的预测由在线软件SWISS-MODEL 完成（图3），建模模板蛋白6rdc.1.X 的氨基酸序列与ClF0F1-ATP 蛋白的氨基酸序列的同源性是36.84%。结果显示，GMQE 值和QMEAN 值分别为0.61 和-4.96，表明该蛋白与线粒体ATP 合酶亚基的相似程度较高，ClF0F1-ATP蛋白功能的预测可以以线粒体ATP合酶亚基的功能作为参考。

图3 ClF0F1-ATP蛋白的三级结构Fig.3 Tertiary structure of ClF0F1-ATP protein

2.4 ClF0F1-ATP蛋白同源序列对比与进化树分析

通过MEGA 6软件构建进化树，将杉木ClF0F1-ATP蛋白与卷柏（s.m）、拟南芥（At）、可可（Tc）等进行蛋白序列对比（图4），结果显示，ClF0F1-ATP 蛋白分布与卷柏（s.m184168）的同源性最高，达到了94%，且两者的模体结构相似度较高，表明ClF0F1-ATP 蛋白与卷柏（s.m184168）亲缘距离很近，由此推测该杉木ATP合酶基因可能与卷柏的线粒体ATP合酶基因执行相似的功能。

图4 ClF0F1-ATP蛋白与其他物种氨基酸序列系统进化树分析Fig.4 Phylogenetic tree and motif analysis of ClF0F1-ATP protein and other species

2.5 ClF0F1-ATP基因的亚细胞定位

最终载体pGWB-35S-ClF0F1-ATP-GFP导入烟草下表皮细胞中后，通过检测荧光蛋白在细胞内分布的位置得出，ClF0F1-ATP 蛋白主要存在于细胞核中（图5），由此可知ClF0F1-ATP基因主要定位于细胞核上。

图5 ClF0F1-ATP蛋白的亚细胞定位Fig.5 Subcellular location of ClF0F1-ATP protein

2.6 ClF0F1-ATP基因对不同胁迫的响应

通过荧光定量PCR 检测在不同胁迫处理下48 h 内杉木种子萌发芽中ClF0F1-ATP基因的表达水平（图6）。

由图6 可知，ClF0F1-ATP基因在不同胁迫处理后的相对表达量均发生显著变化。从图中a、c、e 可以看出，ClF0F1-ATP基因在未经胁迫以及经过不同胁迫后的杉木种子萌发芽中均有表达，该基因在低强度干旱、低盐以及低温胁迫下的相对表达水平均高于对照组（0 h），且表达量随时间延长都呈现先上升后下降的趋势，并在处理12 h后达到最高点，分别是对照组的69.3倍、52.2倍和106倍，说明ClF0F1-ATP基因受上述低强度胁迫诱导表达，该基因可能参与调控杉木低强度逆境胁迫的响应，但具体调控机制可能有所不同。由图中b、d、f可知，杉木ClF0F1-ATP基因在高强度干旱、高盐以及高温胁迫下相对表达量均低于对照组，说明高强度胁迫抑制该基因的表达。杉木ClF0F1-ATP基因在高强度干旱处理下表达量随时间延长主要呈现下降趋势，在高盐胁迫以及高温胁迫后表达水平随时间延长变化不大，其中高温胁迫后的基因相对表达量均远低于对照组，而高盐胁迫后的基因相对表达量略低于对照组，说明高温胁迫对杉木ClF0F1-ATP基因表达的抑制作用更强。

图6 ClF0F1-ATP基因在不同胁迫处理下的表达Fig.6 Expression of ClF0F1-ATP gene under different stress

3 结论与讨论

三磷酸腺苷（ATP）是植物细胞中普遍应用的能量载体，作为细胞中的能量通货，参与植物生长过程中的各项生命活动。此外，ATP 不仅是引发钙传导的重要信号，还可以激活MAPK 级联信号调控系统，在植物抵御不同的恶劣环境时起到调节作用[15]。植物细胞内的ATP由ATP合酶催化合成，ATP合酶是一种辅助因子也是重要的应激酶[16]。

杉木既是我国的主要用材树又是我国主要的造林树种，通过提高杉木抗逆性实现杉木的速生丰产对造林建设以及满足市场需求有很大的意义。本研究克隆得到杉木ClF0F1-ATP基因，长度为618 bp，经ProtParam 工具分析得到，ClF0F1-ATP 蛋白由205 个氨基酸组成，相对分子量为21 856.13 Da，理论等电点为6.20，是稳定的疏水性蛋白。通过ClF0F1-ATP基因编码同源性分析以及系统进化树的构建发现，该基因编码氨基酸序列与卷柏（s.m184168）的序列同源性最高，为94%，通过模体分析也显示杉木ClF0F1-ATP 蛋白与卷柏（s.m184168）亲缘关系很近，可能蛋白质执行相似的功能。ClF0F1-ATP 蛋白的三级结构分析结果显示其与线粒体ATP 合酶亚基结构相似，两者的功能可能有相似之处。通过构建杉木ClF1F0-ATP基因的过表达载体发现该基因定位于细胞核，这与周红娟等[17]研究F0-ATP 合酶b亚基基因的亚细胞定位结果一致。

植物在大自然生长的过程中会遇到各种各样的逆境胁迫，为适应和抵御这些胁迫，植物体内会产生一系列的变化，从而形成复杂的基因表达响应机制，通过自我调节来保护自己免受伤害[18]。有研究发现，Md VHA-A基因可以提高转基因烟草幼苗抵御干旱的能力[19]。王景娜等[20]和杜巧丽等[21]研究发现SbWRKY71基因在高粱应对干旱胁迫和盐胁迫时起到一定作用。朱旭东等[22]发现FeTCP1基因在甜荞遭遇干旱胁迫后的表达量显著升高，由此推测FeTCP1基因与甜荞在干旱胁迫下的响应机制有关。近年来很多学者对植物应对逆境胁迫的基因响应展开研究并取得大量进展，但鲜见关于ATP 合酶在植物应对非生物胁迫时作用的报道。

有研究表明，植物在遭受逆各种境胁迫时由于大量的消耗ATP，从而产生过多的活性氧，不利于植物的生长。Block 等[23]发现通过抑制PARP 酶活可以有效地减轻逆境胁迫下ATP 过度消耗的情况，从而达到提高植物抗逆性的效果。有研究发现ATPase-E基因在小麦遭遇盐胁迫时的表达量上调[24]，且该基因表达水平的提高也增强了转基因拟南芥对盐胁迫的抗性[25]。以上研究结果说明ATPase-E基因对提高植物抗逆性有显著作用。

研究通过检测杉木种子芽内ClF1F0-ATP基因在高温、低温、高盐、低盐以及PEG 模拟高强度干旱、低强度干旱胁迫下48 h 内的表达情况发现，该基因在杉木种子萌发芽受不同胁迫下以及未受胁迫时均有表达。杉木ClF0F1-ATP基因在低强度干旱胁迫、低温胁迫、低盐胁迫下表达量均显著高于对照组且呈现先上升后下降趋势，并在12 h 达到最高点，其中低温胁迫下12 h 的表达水平高于低强度另两组，由此推测杉木通过ClF1F0-ATP基因的过量表达来抵御上述逆境胁迫，且该基因对低温胁迫的响应更为强烈。在高强度干旱胁迫、高温胁迫以及高盐胁迫下杉木ClF0F1-ATP基因表达水平均低于对照组，其中在高温胁迫下的表达水平最低，由此推测高温、高盐以及高强度干旱抑制该基因的表达，且高温的抑制作用更强。

综上，本研究初步讨论了ClF0F1-ATP基因在杉木对抗低强度和高强度非生物胁迫时的表达情况，结果表明该基因可能在杉木遭受低强度胁迫时起重要调控作用，但ClF0F1-ATP基因的具体功能以及其杉木对抗不同逆境的调控机制还需要进一步研究探索。

致谢：福建农林大学高峰学科项目（71201800739）同时对本研究给予了资助，谨致谢意！