产香真菌的鉴定及挥发性成分分析

范露，李婵娟，阙凤，董梦莹

(1.武汉设计工程学院 食品与生物科技学院，武汉 430205；2.湖北工业大学 生物工程与食品学院，武汉 430068)

香精、香料的应用非常广泛，特别是在食品加工、化妆品研发、化工和制药工业等方面都是必不可少的[1]。目前天然香精、香料的获得方法主要有以下几个方面：从植物中直接提取，培养植物细胞进一步提取，酶合成法以及通过微生物发酵来获得[2]。其中，通过微生物发酵来获取这一方法最受人们的关注，因为微生物能高效利用天然原料进行催化合成大量的天然香料产物[3]。而想要利用微生物发酵来生产天然香精、香料，最关键的问题就在于首先要获得一株生产性能良好的菌株[4]。微生物可通过直接生物合成和生物转化两种途径发酵合成各种天然香气成分，而真菌是合成生产天然挥发性香气物质的重要资源之一[5-6]。

产香微生物在工业生产中应用非常广泛，如在烟用香料[7]、白酒[8]、茶叶[9]、馒头[10]、泡菜[11]、酱油[12]、醋[13]、豆瓣酱[14]、发酵辣椒[15]等产品中应用较多，采用微生物发酵法获得香味成分具有产香菌生长迅速且易于进行基因工程改造优化等优点,受到越来越多的重视和开发，而这些研究的关键在于获得生产性能好的菌株，因此对于产香功能性微生物的筛选鉴定、致香成分分析等研究具有较高的理论和应用价值，为其应用领域的进一步拓宽提供了依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

土豆：市售；菌株3-7、5-3、5-8：由本实验室前期从土壤中分离保存；琼脂糖、TAE、蜗牛酶、蛋白胨、酵母浸膏、琼脂、PCR试剂：均为生化试剂，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；真菌DNA提取试剂盒、上样缓冲液、λ-DNA-Hind Ⅲ Marker和溴化乙锭：中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

DNR Bio-Imaging Systems B1S910型凝胶成像仪；Agilent 7890B-7000C型气质联用仪；SPX-430型生化培养箱 宁波江南仪器厂；JJ-CJ-2FD型超净工作台 苏州市金净净化设备科技有限公司；10-B7579型灭菌锅 上海博迅医疗生物仪器股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 形态鉴定

将3株菌株分别接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)上，用封口膜进行密封，置于28 ℃恒温培养箱中培养3～5 d，观察菌落形态和个体形态。同时分别取每株菌株1 mL的菌液加到2 mL的离心管中，再向离心管中加入500 μL的甘油，在121 ℃的条件下灭菌20 min进行甘油保菌，便于后续试验的进行。每天在固定时间段测量菌落半径。用接种针在菌落上挑取部分菌体，在显微镜下进行观察。

1.3.2 分子鉴定

将3株菌株接种到含有10 mL的酵母膏葡萄糖琼脂液体培养基的50 mL离心管中，于28 ℃、150 r/min的恒温振荡培养箱中培养3 d。用移液枪和1 mL的离心管小心地吸取在50 mL离心管底部的菌体，每次吸取体积为1 mL，放入1.5 mL的离心管中。将含有菌体的离心管放入离心机中在12000 r/min的条件下离心1 min。小心吸取上清部分，尽量将培养基全部吸出。重复以上步骤3次，再取100 μL浓度为0.2 mg/mL的蜗牛酶加入离心管中，为了防止蜗牛酶降解，再加入10 μL浓度为0.05 g/mL的EDTA。将加入上述试剂的离心管置于45 ℃的水浴锅中反应1 h。将提取到的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶成像仪观察判定DNA提取是否成功。将扩增后DNA进行琼脂糖凝胶电泳，通过在凝胶成像仪下判定是否扩增成功，成功扩增后将得到的DNA进行BLAST分析。

1.3.3 发酵挥发性成分萃取及鉴定

采用顶空萃取挥发性成分后进行GC-MS分析，同时以不接种的培养基作为空白对照。色谱条件：色谱柱DB-5(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度300 ℃，分流比50∶1，进样量1 μL，初始温度35 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升至200 ℃，保持0 min，以20 ℃/min升至250 ℃，保持10 min。质谱条件：EI离子源，传输线温度300 ℃，电离能量70 eV，离子源温度230 ℃。采用面积归一化法进行定量。

2 结果与分析

2.1 产香菌株的鉴定

2.1.1 形态鉴定

菌株3-7在PDA培养基上的形态见图1。

(1)培养1 d (2)培养5 d (3)镜检(1000×)

由图1可知，28 ℃下恒温培养3 d后，菌落直径可达70～74 mm，菌丝密集，呈绒毛状向四周蔓延，边缘均匀，表面不光滑，中间有凸起，菌丝呈白色；显微镜下可以观察出为有隔菌丝；分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，分生孢子头呈扫把状，分生孢子直径约为3 μm。

菌株5-3在PDA培养基上的形态见图2。

(1)培养1 d (2)培养5 d (3)镜检(400×)

由图2可知，28 ℃下恒温培养3 d后，菌落直径可达8～10 mm，表面平滑，边缘光滑，菌落为乳白色，颜色均一，表面湿润有光泽，黏稠易挑起；菌体呈卵圆形；繁殖方式为多边出芽，细胞直径约为3 μm。

菌株5-8在PDA培养基上的形态见图3。

(1)培养1 d (2)培养5 d (3)镜检(1000×)

由图3可知，28 ℃的培养条件下恒温培养3 d后，菌落直径可达69～72 mm，菌丝密集，呈绒毛状向四周蔓延，边缘均匀，表面不光滑，中间有凸起，菌丝呈白色；显微镜下可以观察出为有隔菌丝；分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，分生孢子头呈扫把状，分生孢子直径约为3 μm。

2.1.2 分子鉴定

按照真菌DNA提取试剂盒上的操作步骤进行DNA的提取后，为了验证是否成功提取到DNA进行琼脂糖凝胶电泳，将电泳结果在凝胶成像仪下进行观察，所得结果见图4。

图4 DNA电泳结果Fig.4 The results of DNA electrophoresis

由图4可观察到拖带现象，分析原因可能是含有蛋白质杂质，但也可以判断出成功提取到菌株的DNA。将成功提取得到的DNA进行PCR扩增，为了验证是否扩增成功进行琼脂糖凝胶电泳，将电泳结果在凝胶成像仪下进行观察，所得结果见图5。

图5 PCR电泳结果Fig.5 The results of PCR electrophoresis

由图5可清楚地观察到PCR扩增结果较为成功，但条带看起来稍有不清晰，可能的原因：一是染色时间不够长，二是染色液浓度较低。

将3株菌株的ITS基因序列通过与NCBI的BLAST检索系统对序列相似性进行分析比较，所得结果见表1。

表1 3株菌ITS基因序列与NCBI的BLAST检索系统对序列相似性分析结果Table 1 The results of similarity analysis of sequence by ITS gene sequence and NCBI BLAST retrieval system of three strains

根据测序结果，菌株3-7、5-8的ITS序列与GenBank中的JQ668740.1序列相似程度最高(相似度为96.10%)，这两株菌初步鉴定为白地霉(Galactomycesgeotrichum)。菌株5-3的ITS序列与GenBank中的NR_153279.1相似程度最高(相似度为100%)，初步鉴定为卡氏念珠菌(Candidacabralensis)，属于假丝酵母属。

2.2 菌株发酵挥发性成分分析

将试管斜面菌种接种到YPD液体培养基中，在28 ℃的条件下摇床振荡培养3 d，然后采用顶空萃取挥发性成分后进行GC-MS分析，同时以不接种的培养基作为空白对照，结果见表2。

表2 各菌株主要挥发性成分Table 2 The main volatile components of each strain

续 表

由表2可知，相对含量大于0.1%和匹配度大于80%的成分，各菌株发酵代谢产物成分总数和种类均有所不同。菌株5-3经过发酵后，相较于空白对照，主要新产生了异丁醇、异戊醇、2,4-二甲基戊烷、N-甲基-N-亚硝基苯胺和苯乙醇等几种成分，其中尤以苯乙醇(相对含量7.07%)和异戊醇(相对含量3.06%)居多，说明菌株5-3是一株代谢产醇能力较强的酵母，并且结合感官判断，发酵产物醇香清新且不刺鼻，闻之非常愉悦；菌株3-7(5-8)代谢后产生了戊酸丁酯、丁酸戊酯、正戊酸正戊酯和苯乙醇等挥发性成分，其中以戊酸丁酯(相对含量2.06%)和苯乙醇(相对含量2.48%)为主，该菌株代谢过程中能产生酯类和醇类等挥发性成分，具有一定的产香能力。菌株代谢产生香气成分与培养基的成分也存在密切关系，后续可作进一步研究。

3 结论

本文对3株产香菌株进行了形态鉴定和分子鉴定。通过菌株在PDA培养基上28 ℃恒温培养，所观察到的形态可以初步判定其中3-7和5-8为霉菌，5-3为酵母菌。为了进一步准确判定3株菌株的菌种类型，分别对3株菌株进行DNA的提取，再进行BLAST分析。根据BLAST分析所得到的结果可以判定3-7和5-8为同一种菌株，为一株白地霉菌，菌株5-3为假丝酵母。GC-MS检测结果表明，菌株5-3是一株代谢产醇能力较强的酵母，发酵产物醇香愉悦；菌株3-7(5-8)代谢能产生一定量的酯类和醇类，具有一定的产香能力。该菌株在微生物发酵法来制取天然香精、香料方面有一定应用潜力。