CNV-seq技术在1 395例高龄孕妇产前诊断中的临床应用评价*

冯暄，郝胜菊，张庆华，何静，张钏，蔺鹏武，郭媛媛，周秉博

(甘肃省妇幼保健院医学遗传中心，兰州 730050)

近年来，随着国家“二胎政策”的开放，高龄孕妇的生育需求增加。孕妇高龄(advanced maternal age, AMA)是导致胎儿染色体异常的重要因素[1]。高龄可造成卵巢功能衰退，卵子逐渐老化以及环境因素的累积，使生殖细胞或受精卵在减数分裂时期发生染色体不分离的风险增加[2]。经典的染色体核型分析技术作为产前诊断的金标准，其分辨率约为10 Mb[3]。近年来，作为高分辨率基因组的染色体微阵列(CMA)技术也逐渐被用于遗传疾病的产前诊断，但其成本较高、通量较低，因此，该技术多用于检测产前诊断中超声结构异常的胎儿[4]。随着二代测序技术的快速发展，低深度全基因组测序技术(CNV-seq)凭借检测范围广、精准、通量高、成本低、操作简便等诸多优势被迅速应用于产前诊断领域。本研究拟将CNV-seq联合染色体核型分析技术应用于高龄孕妇的产前诊断，以期进一步探讨CNV-seq技术在高龄孕妇产前诊断中的临床应用价值。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2018年1月至2019年12月于甘肃省妇幼保健院医学遗传中心单纯因高龄行羊水穿刺的羊水样本1 395份。纳入标准：(1)孕妇年龄≥35岁；(2)胎儿超声检查结果显示为正常；(3)无临床病历资料缺失；(4)均为单胎妊娠。排除标准：(1)既往有不良孕产史者；(2)产前筛查结果显示为高风险病例；(3)孕期接触过有害因素者；(4)交流沟通能力障碍或伴有精神疾病者。孕妇年龄35～54岁，孕周18+4～28周。样本均进行CNV-seq和染色体G显带核型分析技术检测。本研究通过甘肃省妇幼保健院医学伦理委员会审核批准(2018院伦审研第30号)，各研究对象及家属均知情同意。

1.2主要仪器及试剂 T100 PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司)，StepOne plus荧光定量PCR仪(美国Life Technologies公司)，NextSeqCN500高通量测序仪(美国Illumina公司)，5810R低速低温离心机、5424小型高速离心机(德国Eppendorf公司)，J2A900超净工作台(苏州净化工程公司)，CKX-41倒置显微镜、CX31-12CO生物显微镜(日本Olympus公司)，DM6000荧光显微镜(德国Leica公司)，QubitFluorometer 核酸定量仪、Forma i160 CO2培养箱(美国Thermo Fisher公司)。核酸提取试剂盒(德国Qiagen公司)，核酸纯化试剂盒(美国Zymo Research公司)，染色体拷贝数变异检测试剂盒(可逆末端终止测序法)、文库构建纯化试剂、NextSeqCN500高通量测序试剂盒(北京贝瑞和康公司)，荧光定量检测试剂盒(美国Kapa公司)，Gibico羊水培养基(美国Thermo Fisher公司)，秋水仙素、EDTA(美国Life Technologies公司)，胰蛋白酶(德国Sigma公司)，Gimsa染液(美国Promega公司)。

1.3方法

1.3.1羊膜腔穿刺及羊水染色体G显带核型分析 羊膜腔穿刺术由甘肃省妇幼保健院产前诊断中心医师经B超引导下进行。每例孕妇抽取3管羊水，每管10 mL，其中2管羊水进行细胞培养，供染色体核型分析，剩余1管进行CNV-Seq检测。羊水样本送至医学遗传中心细胞遗传实验室，按照标准的操作方法进行细胞培养，经2 000 r/min离心10 min，弃上清液，取1.5～2.0 mL羊水及沉淀细胞，吸吹打匀后接种于含羊水培养基的培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养,6～7 d后换液1次，观察细胞生长情况。8～12 d收获，当细胞贴壁生长旺盛，镜下见大片克隆且有较多圆型及双核细胞时即可收获。收获前加入浓度为100 μg/mL的秋水仙素100 μL，采用2.5 g/L胰蛋白酶和20 g/L EDTA 1∶1混合消化。再经过低渗、预固定、固定、制片等步骤，制得的标本按照人类细胞遗传学国际命名体制(2013)标准，在光学显微镜下计数20个中期分裂相，分析5个核型。

1.3.2羊水细胞CNV-seq检测 取10 mL羊水，按照染色体拷贝数变异检测试剂盒说明书进行样本基因组DNA提取，对获得的DNA用核酸纯化试剂盒进行纯化。按照染色体拷贝数变异检测试剂盒(可逆末端终止测序法)说明书构建 DNA 文库。采用NextSeq CN500 高通量测序试剂盒及NextSeqCN500高通量测序仪对纯化、定量后的 DNA 文库进行测序。比对分析：将获取的读长和已知的人类参考基因组进行完全匹配比对。在此过程中需将人类基因组分成若干个连续区域，统计不同区域内的样本完全匹配读长数，按照统计结果完成样本间的Log2比值计算，并通过特定算法判定待测样本的染色体情况。

1.3.3生物信息学分析 测序所得的读长与人类参考基因组(NCBI GRCh37，UCSC release hgl9)进行比对，分析得到生物信息学结果，通过检索Decipher数据库(Database of chromosomal imbalance and phenotype in humans using ensemble resource)、在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)、PubMed数据库和UCSC Genome Browser(University of California Santa Cruz)、Clinvar等数据库查询，对检测到的CNV的致病性进行评估。最终参照美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)遗传变异分类标准与指南[5]，将检测样本中发现的CNVs 分为以下 5个级别：明确致病性CNVs(pCNVs)，可能致病CNVs(LP CNVs)，临床意义未明CNVs(VUS CNVs),良性 CNVs(B CNVs),可能良性 CNVs(LB CNVs)。

1.4统计学分析 采用 SPSS 20.0统计学软件进行分析。应用相关性分析评估pCNVs发生的片段大小、疾病种类与孕妇年龄的关系，以P<0.05为差异有统计学意义。

1.5随访 对检测出的19例pCNVs样本进行随访，12例选择了终止妊娠，7例选择继续妊娠，目前均尚未见异常表型，但年龄最大的婴儿目前尚出生后不满1年，是否有发育迟缓及智力低下等其他表型目前尚不能充分判断，需继续追踪随访才能明确预后。

2 结果

2.1染色体G显带核型分析结果 1 395例样本中检出染色体异常49例，阳性检出率为3.51%(49/1 395)。检出染色体非整倍体异常28例(嵌合体2例)，检出率为2.00%(28/1 395)；染色体平衡易位3例；染色体多态18例，检出率为1.29%(18/1 395)。

2.21 395例羊水样本CNV-seq检测结果 检出染色体非整倍体及100 Kb以上的拷贝数变异134例，阳性检出率为9.61%(134/1 395)。检出染色体非整倍体异常30例(其中嵌合体5例)，检出率为2.15%(30/1 395)；pCNVs 19例，检出率为1.36%(19/1 395)，VUS CNVs 37例，B CNVs/LB CNVs 48例。见表1。

表1 1 395例孕妇CNV-seq检测结果[n(%)]

2.3CNV-seq与染色体核型结果分析 在嵌合体检测中，两种方法共检出嵌合体5例，有3例嵌合体用核型分析和CNV-seq均检出，有2例用CNV-seq检出而核型分析未检出。另外，CNV-seq检测出的19例pCNVs用染色体核型分析均未检出。CNV-seq未能检出核型分析检出的4例结构平衡易位。

2.4CNV-seq检出样本的pCNVs结果分析 在检出的19例pCNVs样本中，检出微缺失综合征(microdeletion syndrome)7例，分别为16p11.2 微缺失综合征、2p16.3微缺失综合征、1p36 微缺失综合征、6q11-q14微缺失综合征、1q21.1复发性微缺失综合征(神经发育障碍的易感位点，2例)、22q13微缺失综合征。检出微重复综合征(microduplication syndrome)4例，分别为18p四体综合征、16p11.2微重复综合征(2例)、1q21.1复发性微重复综合征。另外,在检出8例其他致病性结果的样本中，检出单基因病2例(病例1、24)，均为进行性肌营养不良(DMD)。病例1为男胎DMD患儿，引产；病例24为女胎DMD携带者，正常分娩，随访。2例样本及其母亲均经MLPA技术验证，结果一致；另有5例为致病性综合征，分别为遗传性压力易感性周围神经病(2例)、先天性桡骨发育不全综合征、9q亚端粒缺失综合征、肾囊肿-糖尿病综合征；另外1例检测结果为XXY综合征。

2.519例pCNVs发生的片段大小、疾病类型与孕妇年龄的关系 19例pCNVs发生的片段大小、疾病种类与孕妇年龄的分布情况见表2。对pCNVs发生的片段大小与年龄进行相关性分析结果显示， pCNVs发生的片段大小与孕妇年龄呈显著负相关性(r=-0.636,P<0.01)。对pCNVs发生的疾病类型与年龄进行相关性分析结果显示， pCNVs发生的疾病种类与孕妇年龄不存在显著相关性(r=0.324，P=0.176)。

表2 19例pCNVs发生的片段大小、疾病类型与孕妇年龄的分布情况

3 讨论

随着高龄孕妇增多，其发生染色体异常的风险也增大。因此，对高龄孕妇的产前诊断和遗传咨询非常关键。本研究通过回顾性分析1 395例高龄孕妇的产前诊断结果，探讨高龄孕妇胎儿染色体核型异常及拷贝数变异检出情况，为临床咨询提供参考依据。

近年来，CNV-seq技术在遗传学诊断和产前诊断中的应用不断深入。《低深度全基因组测序技术在产前诊断中的应用专家共识》[6]为CNV-seq技术在产前诊断中的规范应用提供了指导建议。有研究报道，孕妇的年龄增长会导致出生缺陷发生率的上升[7]。在本研究中，高龄孕妇胎儿染色体异常检出率为9.61%，较文献[8]报道羊水穿刺指征的检出率(3.96%)明显升高，亦高于新生儿自然发生率(0.67%～0.83%)。Wang等[9]报道CNV-seq技术相较于核型分析对致病性或可能致病性CNVs的检出率由1.8%提高至2.8%。Zhu等[10]对全国各地46 258例高龄孕妇的羊水核型分析结果表明，致病性染色体异常的检出率为1.53%。Wang等[11]对CNV-seq技术与芯片的临床应用进行比较分析，结果证实与芯片相比，CNV-seq技术不仅对DNA起始量要求更低，拥有更高的检测分辨率，并且对致病、可疑致病性CNVs检出率提高了1.7%，技术重复率从4.6%降低至0.5%。在本研究中，染色体异常检出率由3.51%上升至9.61%，pCNVs样本检出率由2.00%提高至3.51%。本研究的结果与Wang等[11]的研究基本一致，但高于Zhu等[10]的研究结果，表明CNV-seq技术有较高的可靠性和准确性，特别是在高龄孕妇的产前诊断中可以显著提高染色体异常的检出率，特别是对pCNVs的检出有着明显优势。CNV-seq依然具有局限性，例如该技术为单端测序，无法检测出不涉及基因剂量改变的染色体异常[12]。本研究采用CNV-seq技术检测漏诊了3例平衡易位。在既往产前诊断中出现胎儿染色体易位时，通过父母核型分析胎儿染色体来源，如果胎儿染色体结果与双亲之一相同，无重复或缺失，则不影响表型和智力发育[13]。

本研究中发现3例核型与CNV-seq结果不一致的样本，其中2例是由于低比例嵌合体导致核型无法被检出。有研究报道，CNV-seq联合染色体核型分析可弥补单一检测方法诊断嵌合体出现误诊的不足[14]。另有研究报道证实CNV-seq技术可检测低至5%的嵌合体[15]。本研究共检出5例嵌合体，其中2例为低比例的染色体非整倍体异常的嵌合体(嵌合比例为15%和12%)，核型均未见异常。染色体核型方法嵌合体检出率为0.22%(3/1 395)，CNV-seq技术的嵌合体检出率为0.39%(5/1 395)。2例结果不一致的样本最终通过荧光原位杂交(FISH)检测，确定结果与CNV-seq结果一致，这也说明了CNV-seq技术在染色体低比例嵌合的检测中具有更高的灵敏度，且能评估整条染色体的拷贝数情况。另1例不一致的样本用CNV-seq检测结果为X染色体p22.33-q28处重复151.38 Mb区域，推测核型为47,XXY；Y染色体q11.1-q12处缺失15.70 Mb区域，包含全部无精子因子(AZF)区，该区域缺失与严重的生精障碍密切相关，会导致严重的少弱精症和无精子症。该样本核型结果：46，XX。排除标本误差后，采用多重连接依赖式探针扩增技术(MLPA)方法将剩余羊水样本对P095探针和P360探针进行检测，P095结果显示，该样本为47，XXY，UTY-1位点缺失(AZF基因位于该区域)SRY基因存在；P360结果显示，该样本AZF基因A、B、C 3个区域均缺失。根据3种方法的结果综合推测，Y染色体上检测出的缺失片段可能插入到X染色体，导致核型结果为46，XX。经查询，该患者为高龄孕妇，如果不进行CNV-seq，其染色体异常有可能无法被检测出。此外，当核型与CNV-seq结果不一致时，须用第3种方法进行验证，为临床提供最准确的依据。

研究证实，CNVs在临床的发生率为1%～1.7%，其发生与孕妇年龄无关，发生率高于唐氏综合征[16]。本研究结果提示在国内高龄孕妇人群中，pCNVs发生与疾病类型并不相关，但孕妇年龄却与pCNVs的片段大小具有显著相关性。尤其发现对于>40岁的高龄孕妇，随着年龄的增大，其发生小片段(<1 Mb)pCNVs的风险越高。这进一步说明了对高龄孕妇使用CNV-seq技术联合染色体核型分析，在产前诊断中具有重要的临床意义。

综上所述，CNV-seq技术不仅能检测出染色体非整倍体异常，还可以发现染色体的微缺失和微重复。因此，在对高龄孕妇实施产前诊断时，将CNV-seq与染色体核型分析技术联合应用，可以为医生提供更详细、全面的胎儿染色体信息，减少误诊、漏诊。该技术将有效提高致病性检出率，降低出生缺陷，为临床的产前咨询提供有效可靠的依据。