循环circRNA作为肺癌液体活检标志物的研究进展*

赵婷，徐秋月，李娅，段勇

(昆明医科大学第一附属医院检验科，昆明 650032)

肺癌是严重威胁人类健康和生命的常见恶性肿瘤之一。据统计，在2020年全球肺癌新发病例约占所有新发癌症病例的11.4%，相关死亡病例占癌症死亡病例的18%[1]。目前，在肺癌诊疗过程中常用的癌胚抗原(CEA)、鳞状细胞癌相关抗原(SCCA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和细胞角蛋白19片段抗原21-1(CYFRA21-1)等经典的血清标志物普遍存在敏感性和特异性不高等问题。为更好地满足临床需求，亟需寻找更具灵敏度和特异性的新型液体活检标志物，以弥补现有诊疗指标的不足，改善肺癌患者的临床诊疗效果。

液体活检主要通过分析各类体液中肿瘤来源的蛋白质、核酸、细胞、外泌体和血小板等，客观、实时、无创地监测肿瘤信息。研究表明，环状RNA(circRNA)有望成为肿瘤液体活检的有力工具，例如circRNA通过调节肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡和侵袭等生理病理过程，参与调节肿瘤的发生和发展；circRNA能稳定存在于外周循环、脑脊液、尿液等体液(包含外泌体)中，且在不同的生理和病理状况下均可检测到特定circRNA的表达水平发生改变，某种程度上可以反映机体的生理病理状态[2]。circRNA不仅在外泌体中富集并稳定存在，且有助于形成肿瘤微环境[3]。循环circRNA在作为肺癌诊断、病情进展、疗效监测标志物及潜在的治疗靶点方面受到越来越多的关注，通过广泛且深入的研究有望筛选出具临床转化潜能的循环circRNA。

1 circRNA的生物学作用

1976年，Sanger等[4]首次发现circRNA时，认为其只是错误剪接的副产物，没有任何有价值的生物学功能。直至2013年，有学者首次发现，circRNA具有microRNA海绵的作用[5]。目前研究[6-7]表明，circRNA主要通过以下4种方式在肿瘤的形成和病情进展中发挥作用：(1)microRNA海绵：许多circRNAs含有1个或多个miRNA反应元件(MREs)，充当microRNA海绵阻止microRNA与目标mRNA结合,从而发挥内源竞争RNA(ceRNA)作用；(2)蛋白质海绵：部分circRNAs能够与RNA结合蛋白(RBP)结合形成RNA-蛋白质复合物，从而阻止circRNA与目标mRNA的结合；或者，通过circRNA与RBP之间的相互调节作用，参与调控蛋白质的表达和功能，如circMbl与肌肉盲蛋白(MBL)等；(3)转录调控作用：内含子circRNA(ciRNA)和外显子-内含子RNA(EIciRNA)主要分布于细胞核内，在转录和转录后水平调控基因表达；(4)翻译功能：少数circRNAs可通过内部核糖体位点(IRES)介导、N6-甲基腺苷(m6A)介导或丰富的开放阅读框(ORFs)3种方式，参与或促进蛋白质翻译的有效启动。

2 circRNA作为液体活检标志物的优势

circRNA是一类由前体RNA反向剪接形成的具有独特共价闭合结构的环状RNA分子，在真核生物和病毒中广泛表达[8]。相比于线性RNA，circRNA缺少5′帽结构和3′A尾，对外切核糖核酸酶(Rnase R)具有高度抗性，不仅能够更稳定地存在于各种组织和细胞中，还能在外周循环、尿液、唾液、脑脊液等体液中富集并稳定存在[9]。circRNA表达具有高稳定性、组织/细胞特异性和广泛表达等优势，是肿瘤新型液体活检的理想候选标志物[10]。此外，由于循环外周血的微创采集模式和易获性，现已成为液体活检的主要体液之一[11]。越来越多的研究也表明，循环circRNA在肺癌的早期诊断、病情监测等方面具有重要意义，其还可能成为肺癌的潜在治疗靶标[12-14]。

3 循环circRNA的定量检测方法

目前，PCR是生物学研究领域中用于circRNA定量分析的常规和经典的检测方法，包括实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、数字PCR(ddPCR)、滚环扩增(RCA)[15-16]、环介导等温扩增(LAMP)[17]和基于DNA探针连接的PCR[18]等。其中，RT-qPCR是对目标circRNA进行相对定量分析的常用方法，也是验证RNA-seq高通量结果的重要方法[19]。但RT-qPCR分析存在灵敏度较低的局限性。ddPCR通过“分而治之”的原理，结合泊松分布可实现对低丰度目标RNA的绝对定量分析，这对于循环circRNA的绝对定量检测特别有价值。Jiao等[16]基于RCA方法开发了一种使用双功能磁珠直接捕获目标circRNA-miRNA复合物(CMRRI)以及信号放大的生物传感系统，可直接检测生物样品中的CMRRI，但不适用于低表达的circRNA。茎环引物诱导的LAMP可精准识别circRNA连接序列，并成功地应用于各种均相溶液中，可灵敏且特异地检测目标circRNA[17]。此外，基于DNA探针连接的PCR法通过在circRNA的连接位点使用splintR连接酶准确连接2个DNA探针，从而实现对circRNA的精准识别和定量检测[18-19]。

4 循环circRNA作为肺癌液体活检标志物的研究现状

循环circRNA不仅可以用于疾病的早期诊断，还能够反映疾病的动态发展情况和治疗效果，且有潜力成为有效的治疗靶标。表1列出了近年来具有较大临床应用转化潜能的循环circRNAs，检测样本主要来自血浆和血清。

表1 肺癌相关的循环circRNAs

4.1循环circRNA有潜力成为肺癌的诊断标志物 已有研究揭示了circRNA作为肺癌液体活检诊断标志物的可能性。Liu等[20]对61例非小细胞肺癌(NSCLC)患者血浆hsa_circ_0046264的表达水平进行检测分析，结果证实血浆hsa_circ_0046264对NSCLC的诊断均具有潜在的临床价值(AUCROC=0.915，敏感性、特异性分别为0.927、0.957)；此外，其还可能成为肺癌潜在的预后标志物和治疗靶点。该研究结果还显示，血浆circRNAs的联合检测可在一定程度上提高诊断效能。hsa_circ_005962与hsa_circ_0086414的联合应用不仅可用于诊断肺腺癌(LUAD)(AUCROC=0.81，敏感性、特异性分别为77.80%、72.22%)，还能区分TNM早期阶段的LUAD患者和健康个体(AUCROC=0.83)[21]。circRNA 除具有较高的早期诊断价值之外，还有潜在的鉴别诊断价值。hsa_circ_0047921可将NSCLC病例与慢阻肺疾病区分开(AUCROC=0.890)，hsa_circ_0056285联合hsa_circ_0007761可区分NSCLC病例与结核病例(AUCROC=0.820)；此外，hsa_circ_0047921、hsa_circ_0056285和hsa_circ_0007761三者联合检测在诊断早期NSCLC病例与健康对照时也具有重要的意义(AUCROC=0.919)[22]。在一项60例肺腺癌和58例健康受试者的队列研究中，单因素和多因素生存分析结果显示，血浆hsa_circ_0001715除具有较高的诊断价值外(AUCROC=0.871)，还可能是肺腺癌患者总生存期(OS)的独立预后因子[23]。

外泌体circRNA也是一种潜在的无创性肿瘤诊断工具。Wang等[24]使用高通量测序分析了6对肺鳞癌(LUSC)患者和健康对照者的血浆外泌体circRNA表达谱，共鉴定出252个差异表达的外泌体circRNAs，其中，上调的外泌体hsa_circ_0014235和hsa_circ_0025880显示出潜在的诊断价值(AUCROC分别为0.825、0.800)。在LUAD中表达上调的血浆外泌体hsa_circRNA_002178对LUAD的早期诊断具有显著的有效性(AUCROC=0.997)[25]。未来有必要进行更多的前瞻性研究及大队列研究，以探索循环circRNA作为肺癌诊断标志物的更多可能性。

4.2循环circRNA有潜力成为肺癌的疗效监测标志物 多项研究通过比较放化疗敏感和耐药患者血浆或血清中差异表达的circRNAs，证实循环circRNA与肿瘤细胞耐药性关系密切，这对于指导临床治疗具有重大意义。circRNA微阵列分析显示，吉非替尼治疗有效组和无效组间共存在1 377个差异表达circRNAs，进一步通过RT-qPCR在独立的验证集中证实hsa_circ_0109320是NSCLC患者表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)疗效预测的潜在指标[26]。Liu等[21]通过比较肺癌患者术前和术后7 d血浆hsa_circ_0005962和hsa_circ_0086414的表达水平，发现血浆hsa_circ_0005962在LUAD术前及术后患者之间有明显差异，并进一步通过生信分析和体外实验证实，hsa_circ_0005962是评估手术治疗效果的潜在标志物。此外，病情进展的实时监测对于改善肺癌患者治疗效果尤其重要。Luo等[27]筛选了231例肺癌患者和41例健康人对照的circRNA表达谱，并对hsa_circ_0000190的表达水平进行临床验证，结果表明hsa_circ_0000190可提示晚期肺癌的肿瘤进展和对免疫治疗的不良反应。

外泌体circRNA在疗效监测方面也显现出重要价值。Fang等[28]发现NSCLC患者血清来源的外泌体CircARHGAP10通过miR-638/FAM83F轴抑制了NSCLC的进展，表明外泌体CircARHGAP10是实现动态监测疾病进程的潜在有效标志物。一项关于hsa_circ_0056616的研究表明，在肺腺癌患者血浆中高表达的外泌体hsa_circRNA_0056616可能是淋巴结转移预测的有效生物标志物[29]。通过全面理解circRNA并挖掘其作为肺癌疗效检测标志物的临床价值，可有效筛选出具有临床应用潜能的循环circRNA标志物。

4.3循环circRNA有潜力成为肺癌的治疗靶标 研究表明，循环circRNA亦具备作为肿瘤新型治疗靶标的潜能。Shi等[30]发现，hsa_circ_0008928敲减可提高NSCLC细胞对顺铂(CDDP)的敏感性，为NSCLC的CDDP耐药疗法提供了新的依据。一项包含28例奥西替尼耐药和32例敏感的NSCLC患者队列研究结果表明，hsa_circ_0002130通过靶向miR-498调节糖酵解进而逆转耐药的发生，在体内和体外均抑制了NSCLC患者对奥西替尼的耐药性，这可能是改善肺癌患者临床治疗的理想措施[31]。多项研究表明，hsa_circ_102481、CircCDYL和CircPIP5K1A也可能是肺癌靶向治疗的新型靶点[12-14]。

5 总结与展望

随着对circRNA的独特分子结构和生物学功能研究的深入，表明循环circRNA有潜力成为肺癌液体活检中具有临床应用价值的诊断、病情监测标志物和治疗靶点。然而，目前液体活检circRNA在生物医学领域研究和临床转化方面依然面临巨大的挑战和困难：(1)circRNA的命名规则尚未统一，在很大程度上阻碍了整个研究领域的快速发展；(2)循环RNA抽提技术和富集方法的有效性均有待突破；(3)目前的研究大多集中于基础研究，需广泛的临床研究证实circRNA用于肿瘤诊疗标志物的可行性；(4)各研究之间缺乏可比性和一致性，需建立相应的标准品、检测方法学标准和质量控制体系；(5)circRNA通过何种方式扩散入外泌体中以及外泌体circRNA丰度的调节机制均有待研究。未来迫切需要加快循环circRNA富集方法、标准品的研发和改进，通过开展科学、创新的基础研究和系统、全面的真实世界队列研究，争取早日实现肺癌循环circRNA检测体系的持续改进和临床转化。