伴BCOR/BCORL1突变的髓系肿瘤共突变基因表达谱及病理参数分析*

李佳，张春玲，杨隽，李鹤，王小蕊

(上海交通大学附属第一人民医院a.检验医学中心,b.血液科,上海 200080)

B细胞淋巴瘤因子6共抑制因子(BCL6 corepressor，BCOR)位于X染色体Xp11.4，共包含15个外显子。BCORL1(BCL6 Corepressor like 1)是BCOR同源基因，位于X染色体Xq26.1，共包含12个外显子。 研究发现，BCOR/BCORL1参与骨髓细胞的增殖与分化，在转录和表观遗传调控过程中起重要作用[1]。BCOR/BCORL1突变常见于骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，MDS)和急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)等髓系肿瘤，可检测到的突变类型包括小片段插入缺失、移码突变、无义突变和剪切位点突变等。多项研究证实，伴BCOR/BCORL1突变的髓系肿瘤患者预后不良，且这些患者的病理参数存在一定差异[2-4]。然而，与BCOR/BCORL1突变同时存在的其他共突变基因是否会引起患者临床病理参数差异，其突变位置和治疗方案是否影响患者预后，国内外尚无相关文献支持。本次研究利用高通量测序技术，回顾性分析本中心伴BCOR/BCORL1突变的髓系肿瘤患者的共突变基因表达谱及其临床病理参数，以期为临床治疗此类突变患者及预后评估提供依据。

1 对象与方法

1.1研究对象 回顾性分析2017年1月至2021年8月在上海市第一人民医院血液科初诊并保留骨髓DNA样本的髓系肿瘤患者943例，参照世界卫生组织2016年髓系肿瘤分型标准对初诊MDS患者、MDS/骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative neoplasm, MPN)患者和AML患者进行诊断及分型[5]。共筛选出伴BCOR/BCORL1突变的AML、MDS和MDS/MPN患者47例，其中AML患者31例(66.0%)，MDS患者14例(29.8%)，MDS/MPN患者2例(4.2%)，患者中男性24例(51.1%)，女性23例(48.9%)，年龄范围44(33～58)岁。

所有标本均在本检验医学中心进行血常规检查、出血和凝血常规检查、骨髓细胞形态学检查、细胞免疫表型分析、白血病融合基因分析和细胞遗传学检查。髓系肿瘤相关基因突变分析由上海睿昂基因科技公司完成。所有患者均知情同意，且经上海市第一人民医院医学伦理学委员会批准(批准文号：院伦审[2021]033号)。

1.2主要仪器及试剂 CX33显微镜(日本Olympus公司)，Navios流式分析仪及配套试剂(美国Beckman-Coulter公司)，NanoDrop超微量紫外分光光度计(美国Thermo-Fisher公司)，Ikaros核型分析系统(德国Metasystems公司)。Wright-Giemsa染液(珠海贝索生物技术公司)，RNA抽提试剂盒、DNA抽提试剂盒(江苏康为世纪生物科技公司)，骨髓染色体培养基(上海乐辰生物科技公司)，逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司)，56种融合基因筛查试剂盒(上海睿昂基因科技公司)。

1.3方法

1.3.1骨髓细胞形态学检查 以髂后或髂前上棘作为穿刺点，抽取骨髓液0.2 mL制成骨髓涂片，经过瑞-吉氏染色，在光学低倍镜下观察骨髓增生程度并计数全片巨核细胞，在分布均匀处通过油镜计数200个有核细胞，并观察细胞形态。所有骨髓片均由2名有经验的骨髓细胞形态学工作者复审,得出结果。

1.3.2骨髓细胞免疫分型 使用Navios多色流式细胞仪检测，用八色荧光抗体标记(FITC、PE、PerCP-Cy5.5、PECY7、APC、APC-H7、V450、PB、BV421、V500)标本。用于分析的抗体包括：CD34、CD117、HLA-DR、CD38、CD123、CD33、CD13、CD15、CD64、CD36、CD11b、CD14、CD19、cCD79b、CD10、CD20、CD5、CD2、CD7、cCD3、CD4、CD8、CD3、CD56、CD16、MPO 等。

1.3.3融合基因检测 抽取各患者EDTA-K2抗凝骨髓2～4 mL，采用柱式抽提盒提取mRNA。采用多重巢式PCR筛查急性白血病相关56种融合基因，包括RUNX1-RUNX1T1、BCR-ABL1、CBFβ-MYH11、KMT2A-MLLT6、KMT2A-MLLT11、KMT2A-MLLT3，KMT2A-MLLT10等。以Ct值<33判为阳性。

1.3.4二代测序(next-generation sequencing, NGS) 抽取各患者EDTA-K2抗凝骨髓2～4 mL，采用磁珠法提取DNA。取1 μg DNA制备DNA全基因组文库。使用PCR引物扩增目的基因组，将目标区域DNA富集后，采用illumina测序平台进行测序。测序后原始数据利用人基因组数据库(hg19/GRCh37)、dbSNP、1000 genomes、HGMD、SIFT 等数据库进行生物信息学分析，确定致病基因的突变位点。平均靶基因覆盖率(on target coverage)≥90%，平均测序深度≥1 000×。用于髓系肿瘤相关基因突变的高通量测序(next generation sequence，NGS)检测，包括NPM1、FLT3、KIT、CEBPA、DNMT3A、IDH1、IDH2、TET2、EZH2、RUNX1、ASXL1、PHF6、TP53、SF3B1、SRSF2、U2AF1、ZRSR2、NRAS、CBL、SETBP1、ETV6、JAK1/2等42种基因热点突变区域。

1.3.5染色体核型分析 收集患者肝素抗凝骨髓细胞2～4 mL,采用短期培养法(RPMI 1640培养液，含20%小牛血清)，依照文献进行染色体制备及显带处理[6]。染色体核型描述依据《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN, 2016)》[7]。

1.3.6随访及疗效评价 随访资料来源于住院病历、门诊病例以及电话随访。随访截止时间为 2021年 8月 31日。完全缓解(complete remission，CR)、部分缓解(partial remission，PR)、未缓解(non-remission，NR)的判定标准参照相关文献进行。总生存(overall survival，OS)时间，定义为首次确诊至死亡或随访截止的时间。无病生存(disease-free survival，DFS)时间定义为首次完全缓解至疾病复发、进展、死亡或随访截止的时间。

1.4统计学分析 采用GRAPHPAD 8.0.1软件进行统计分析。BCOR/BCORL1突变组与野生型组中不符合正态分布的计量资料数据以中位数(四分位数间距)[M(P25,P75)]表示，组间比较使用Mann-WhitneyU检验，两组间率的比较采用卡方(χ2)检验，BCOR/BCORL1突变位置、治疗方法对髓系肿瘤患者生存(DFS、OS)的影响应用Kaplan-Meier生存分析(Log-Rankχ2值)。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1BCOR/BCORL1患者的突变类型 47例患者中，BCOR突变患者33例(占70.2%)，BCORL1突变患者14例(占29.8%)。BCOR/BCORL1突变在AML和非AML(MDS和MDS/MPN)患者中的分布差异无统计学意义(χ2=8.825,P=0.066)，见表1。依据突变类型，点突变在AML患者中出现频率较高，占51.1%(24/47)，MDS和MDS/MPN患者中以移码突变、缺失突变和剪切体突变等其他类型突变为主，占19.1%(9/47)，分布差异有统计学意义(χ2=7.458,P=0.006)。

表1 BCOR/BCORL1突变患者的临床病理参数

2.2BCOR/BCORL1突变患者共突变基因表达谱及功能分类 通过高通量测序检出共突变基因28个。除BCOR/BCORL1外，6.4%(3/47)的患者不伴有其他基因突变；38.3%(18/47)的患者至少伴有1个基因突变；55.3%(26/47)的患者伴2个及以上基因突变。

依照突变基因功能分类，共突变基因涉及多个通路，发生频率较高的依次为DNMT3A(19.1%，9/47)、IDH2(17.0%，8/47)、IDH1(12.8%，6/47)、WT1(12.8%，6/47)、RUNX1(10.6%，5/47)、TP53(10.6%，5/47)和NRAS(10.6%，5/47)。伴BCOR/BCORL1突变髓系肿瘤患者突变共存关系见图1。共突变频率最高的通路依次是转录因子相关基因突变(31.9%，15/47)、代谢酶相关基因突变(29.8%，14/47)、信号传导通路相关基因突变(27.7%，13/47)、甲基化相关基因突变(25.5%，12/47)、染色质与黏附分子相关基因突变(23.4%，11/47)和剪切子相关基因突变(10.6%，5/47)，突变分类、相关突变基因及突变率见表2。

图1 47例BCOR/BCORL1髓系肿瘤突变患者共突变基因表达谱

表2 共突变基因谱中涉及的突变基因及突变率

2.3BCOR/BCORL1突变患者病理参数分析BCOR突变组与BCORL1突变组在性别和年龄等临床病理参数上的差异无统计学意义。但BCOR突变组患者WBC计数显著低于BCORL1突变组患者 (Z=2.730,P=0.006)。其他纳入分析的临床病理参数在两组间的差异无统计学意义(表1)。通过共突变基因谱分析发现，代谢酶组突变患者WBC计数(Z=-3.500，P=0.018)、PLT计数(Z=82.500，P=0.027)、Fib含量(Z=-0.935，P=0.008)显著低于野生型患者，TT明显延长(Z=0.800，P=0.027)，差异均具有统计学意义；甲基化组突变患者Fib含量显著低于野生型患者，差异具有统计学意义(Z=-0.855，P=0.030)；信号通路相关基因突变患者WBC计数显著高于野生型患者，差异具有统计学意义(Z=5.500，P=0.019)；转录因子相关基因突变患者PT短于野生型患者，差异具有统计学意义(Z=-1.600，P=0.008)。见图2。

注：*，P<0.05；**，P<0.01。

2.4BCOR/BCORL1突变患者生存及预后分析 伴有BCOR/BCORL1突变患者中位随访时间为419(237,778)d，中位DFS时间为180(61,412)d。其中,伴BCOR突变患者的中位随访时间和中位无白血病生存期(LFS)时间为170(61,412)d，伴BCORL1突变患者中位随访时间和中位LFS时间为196.5(74，385)d，二者OS和DFS之间差异均无统计学意义(χ2=0.390,P=0.532；χ2=0.626,P=0.429)。结构域突变患者中位DFS时间明显短于非结构域突变患者(χ2=4.920,P=0.027)，但对患者的OS没有影响(χ2=2.787,P=0.095，图3)。突变的种类(是否为点突变)、伴有的共突变数量等对DFS和OS均无影响。

61.7%(29/47)的突变患者进行异基因造血干细胞移植。进一步分析发现，移植组患者中位DFS时间(χ2=7.703,P=0.006)和中位OS时间(χ2=13.380,P=0.000)均明显高于未移植组患者，差异有统计学意义(图3)。

注:A，结构域突变组与非结构域突变组DFS和OS曲线；B，移植组与未移植组患者DFS和OS曲线。

3 讨论

基因组DNA突变与髓系肿瘤的演化、治疗和预后密切相关[8-9]。超过30%的MDS和MDS/MPN会进展为AML，同时MDS和MDS/MPN中的一些突变相互重叠并且在进展为AML后逐渐成为优势克隆，提示髓系肿瘤可能拥有共同基因表达谱[10]。

BCOR/BCORL1被证实是髓系肿瘤中反复发生的分子遗传事件[11]。BCOR和BCORL1突变频率在各研究组间存在差异，目前文献报道BCOR在髓系肿瘤中的发生率为4%～12%，BCORL1的突变率为0.8%～13%[12-13]，分析原因后笔者推测和疾病种类、人种及地域有关。本中心发现的BCOR突变率约为3.5%(33/943)，BCORL1突变率约为1.5%(14/943)，与上述国内文献报道基本一致。

进一步分析BCOR/BCORL1突变患者病理参数发现，BCOR和BCORL1突变患者年龄、性别、PLT、红细胞、APTT、TT和Fib等差异无统计学意义，但BCOR突变患者WBC计数显著低于BCORL1患者，且BCOR突变的AML患者WBC中位数显著低于参考区间。岑燕霞等[13]发现，MDS中BCOR突变型患者的WBC显著低于野生型，提示伴BCOR突变具有原始细胞过度增殖但WBC增生减低的特性。另有学者证实，BCOR突变和丢失可导致BCORmRNA表达量下降，引起髓系祖细胞无序增殖，抑制分化，进而导致伴BCOR突变的AML患者外周血WBC增生低下[1,3,11]。这与本研究观察到的结果一致，推测此类患者可能更易发生严重感染。

髓系肿瘤往往伴随多种突变发生，本研究中最常见的共突变基因是转录因子突变和甲基化突变，与国内外髓系肿瘤基因谱结果基本一致[4,13]。其中代谢酶组突变患者WBC和PLT计数显著低于野生型患者，同时TT显著高于野生型患者，代谢酶突变组和甲基化突变组Fib含量明显低于野生型患者，说明伴有这些共突变患者出血倾向可能更为明显。Fib与髓系肿瘤突变是否具有相关性，目前尚未有相关文献支持，但在脑胶质瘤研究中已发现代谢酶基因突变(IDH1/2)与Fib含量减低有相关性，提示该突变可能与凝血相关基因表达调控有关，有学者推测在髓系肿瘤中代谢酶也具有类似作用，但需扩大样本量进一步研究[14]。

既往研究证实，伴BCOR/BCORL1突变的髓系肿瘤预后不良，但突变位置是否影响预后国内尚未见相关报道。本研究显示，虽然结构域突变比非结构域突变的患者DFS时间更短，但对OS无影响，提示突变发生在结构域对BCOR/BCORL1功能影响更为显著。Abuhadra等[2]在对MDS患者的BCOR/BCORL1结构域的研究中发现，结构域突变患者OS明显低于非结构域突变患者，预后不良，不一致原因考虑与样本数量及病种有关。本研究中无论患者移植前是否缓解，相比常规化疗，异基因造血干细胞移植可有效延长突变患者的DFS和OS，因此，伴BCOR/BCORL1突变的患者在条件允许情况下，应尽早进行移植以改善生存。

综上所述，伴BCOR/BCORL1突变的髓系患者具有更低的外周血WBC计数，共表达代谢酶和甲基化突变的患者血浆Fib含量更低，具有更为明显的出血倾向。异基因造血干细胞移植能有效延长BCOR/BCORL1突变患者生存期，因此，具有该类突变患者应尽早进行移植。对髓系肿瘤患者进行NGS检测，有助于此类患者预后分层评估和治疗选择。考虑到本研究收集的病例数较少，笔者未将BCOR和BCORL1分开进行共表达谱的分析，两者之间的共表达谱突变是否存在差异，尚需扩大样本量进一步讨论。