广叶绣球菌中性多糖对巨噬细胞RAW 264.7细胞因子及TLR2受体的影响

魏 欣，王萌皓，云少君，程艳芬，曹谨玲，常明昌，2，冯翠萍

（1.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷 030801；2.山西省食用菌工程技术研究中心，山西 太谷 030801）

多糖作为一种生物活性大分子物质，在维持人体机能、提高免疫、降血糖、降血脂、抗肿瘤等方面发挥着重要的作用[1]，多糖生物活性的发挥与受体对其的识别密切相关。Toll样受体（TLRs）、C型凝集素样受体等免疫识别受体是多糖发挥免疫调节作用的关键，不仅可以识别多糖，与之结合触发一系列下游信号传导，还可以促进免疫相关细胞因子的释放或基因的表达，激活机体免疫反应。TLRs是一类跨膜受体，为介导识别病原体相关分子模式的Ⅰ型跨膜蛋白，主要在巨噬细胞和树突状细胞等吞噬细胞表达，能够将感应到的胞外信号，通过接头蛋白传递到胞内，使核内相关基因得到表达，最终激活NF-κB、MAPKs下游信号转导通路[2]。此家族受体能识别多种配体，例如脂多糖、甘露聚糖、肽聚糖、脂肽、酶原、脂质体酸、鞭毛蛋白等。不同TLRs的功能和作用不同，导致其在细胞上的表达位置也不同，其中TLR2和TLR4这2个与炎症及免疫调节关系密切的受体分布于细胞表面，且是多糖的主要受体[3]。目前，已经发现灵芝多糖、猪苓多糖、巴氏蘑菇多糖[4-6]等均可通过TLR4发挥一定的免疫调节作用。TLR2结构组成类似于其他Toll样家族受体，广泛存在于多种与免疫作用相关的细胞以及一些非免疫细胞中，与TLR2结合的配体较多，主要有脂多糖、肽聚糖、酵母多糖、脂蛋白等，且识别形式为同二聚体或者异二聚体，研究发现，许多植物或者细菌多糖是通过TLR2来介导的[3]。之前研究表明，猴头菇多糖与羊肚菌多糖均可以通过TLR2受体提高巨噬细胞的吞噬活性[7-8]。YUE等[9]研究表明，阻断TLR2表达，会减弱白芨多糖对人肾小球系膜细胞的抗炎作用，说明白芨多糖发挥抗炎作用与TLR2有关。闫慧丹[10]研究发现，TLR2是巨噬细胞RAW 264.7识别香菇多糖的主要受体之一。SU等[11]研究发现，灰树花中β-葡聚糖可通过TLR2受体激活巨噬细胞，刺激细胞因子的产生，且其调节作用独立于Dectin-1和CR3。LEE等[12]研究表明，蛹虫草多糖可通过模式识别受体TLR2，介导MAPK和NF-κB信号通路，促进NO、TNF-α的产生并增强巨噬细胞的吞噬能力。尽管有关多糖免疫作用调节机制的研究已有很多，但不同来源的多糖因结构不同，免疫作用的发挥机制亦有所不同。

广叶绣球菌（Sparassis latifolia）作为珍稀名贵的食药用菌之一，富含多糖、多酚、甾醇类等活性物质，具有多种生物活性调节作用[13-16]，尤以多糖含量高达39.3%~43.6%，具有诱导树突细胞的成熟、增强免疫活性等作用[17]。HARADA等[18]研究发现，环磷酰胺诱导小鼠发生白血病后，腹腔注射绣球菌多糖，可增加小鼠体内免疫细胞数量，降低CD4+和CD8+T淋巴细胞的数量，提高细胞因子TNF-α、IL-6等的生成。KIM等[19]研究表明，绣球菌多糖能够通过TLR4介导的下游信号转导通路MAPK和NF-κB，活化树突细胞，激活机体免疫应答。LEE等[20]研究发现，绣球菌多糖可以通过2种途径促进NO的产生，其中一种是提高iNOS的分泌，第2种是通过MAPKs信号转导通路。

山西农业大学食品科学与工程学院食品营养与安全课题组前期研究结果显示，广叶绣球菌酸性多糖[21]可通过TLR4受体激活信号转导通路，增加IL-6、TNF-α和IFN-β的分泌量，调节RAW 264.7细胞的免疫功能，但有关广叶绣球菌中性多糖（Sparassis latifolianeutral Polysaccharides，SNP）的免疫调节作用及作用靶点的研究还罕见报道，对于SNP是否通过TLR2来介导发挥免疫活性目前还未有研究。

鉴于此，本试验采用传统水提法经过分离纯化后得到SNP组分，对其进行结构表征，通过研究SNP处理后巨噬细胞RAW 264.7的增殖活力和巨噬细胞分泌的细胞因子的含量变化，以及经TLR2受体的抗体处理巨噬细胞后其细胞因子的变化，对SNP影响巨噬细胞RAW 264.7细胞因子的分泌及TLR2是否介导该过程进行分析，旨在为SNP的进一步开发利用奠定一定的理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 供试广叶绣球菌由山西省清徐县太和食用菌栽培基地提供。

1.1.2 主要试剂及仪器设备 小鼠巨噬细胞RAW 264.7（中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心）；NO、TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-β试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）；脂多糖（LPS）（Sigma公司）；乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等均为国产分析纯。

主要仪器设备为PL3000冷冻干燥机（Thermo公司）、Spectra Max i3x酶标仪（Thermo公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 SNP的纯化和分子量测定 采用水提醇沉法提取，并经HZ-830大孔树脂吸附后得到粗多糖，经DEAE-52纤维素阴离子交换柱和Sepharose CL-6B凝胶柱的洗脱，分离纯化得到SNP[22]。采用高效凝胶色谱法测定SNP的分子量大小。

1.2.2 SNP结构和组成分析 采用FT-IR法测定SNP的红外光谱特征，设定的扫描范围为400~4 000 cm-1。采用IC法对SNP单糖组成进行测定，组分比值用各单糖的相对峰面积比值表示。

1.2.3 SNP对巨噬细胞RAW 264.7增殖活力的影响 参照文献[21]，通过MTT法进行测定。具体步骤为：取细胞浓度为1.0×105个/mL的细胞接种于96孔板中培养过夜。设1.95、3.9、7.812 5、15.625、31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000、4 000μg/mL共12个不同质量浓度梯度的SNP溶液，吸弃96孔板中旧培养基后加入多糖溶液，同时设对照组和调零组，每组设立6个复孔，培养24 h。将MTT加入每个反应孔中继续培养4 h。弃去MTT溶液，每孔加入DMSO，摇床15 min，酶标仪554 nm处测定吸光值。

1.2.4 SNP对巨噬细胞RAW 264.7细胞因子分泌量的影响 参照文献[21]进行测定。具体步骤为：选择细胞浓度为5.0×105个/mL的细胞过夜培养，使其贴壁后弃去旧培养基。将含有终质量浓度为1μg/mL LPS、含有不同质量浓度（62.5、125、250、500μg/mL）SNP和空白对照组的细胞培养液分别加到细胞培养板中，每组设4个复孔，作用24 h后按照NO、IL-6、TNF-α、IFN-β试剂盒说明书，用ELISA法测定各组上清液中NO、IL-6、TNF-α、IFN-β的含量。

1.2.5 SNP对TLR2抗体作用后巨噬细胞RAW 264.7细胞因子分泌量的影响 参照文献[21]进行测定。选择细胞浓度为5.0×105个/mL过夜培养，使其贴壁后弃去旧培养基。用20μg/mL的TLR2抗体作用巨噬细胞1 h后弃去，将含有终质量浓度为1μg/mL LPS、含有终质量浓度为250μg/mL的SNP和空白对照组的细胞培养液，分别加入到细胞培养板中，每组设4个复孔，作用24 h后收集细胞上清液。按照NO、IL-6、TNF-α、IFN-β试剂盒说明书，用ELISA法测定上清液中NO、IL-6、TNF-α、IFN-β的含量。

1.3 数据处理与分析

结果以平均值±标准差表示。通过Graphpad Prism 5.0软件作图；采用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析和邓肯多重比较，以P<0.05作为差异具有统计学意义的判定标准。

2 结果与分析

2.1 SNP的分离纯化及分子量的测定

SNP的分离纯化结果及分子量大小如图1所示。

由图1-A可知，绣球菌多糖经DEAE-52分离得到的水相多糖组分再经Sepharose CL-6B分子筛作用后，获得1个吸收峰，收集并冷冻干燥得到中性多糖组分，SNP呈现单一对称峰型，分离效果良好，为均一多糖；而高效凝胶色谱结果表明（图1-B），得到的SNP纯度较高，分子质量（Mw）为3.2×105u。

2.2 SNP结构和组成分析

由图2-A可知，SNP在3 405.76 cm-1附近出现又宽又钝吸收峰，是由于多糖分子之间或者分子内部氢键O-H与N-H的伸缩振动造成的；2 929.8 cm-1附近出现峰是亚甲基-CH2-中C-H的伸缩振动；官能团COO-中的C=O的非对称伸缩振动使得在1 631.67 cm-1处有强吸收峰；1 383.3、1 350 cm-1处的吸收峰是由于C-H的弯曲振动；醚键C-O-C和C-O-H中C-O的伸缩振动使吸收峰出现在1 200~1 000 cm-1，吡喃糖苷吸收峰出现在1 100~1 010 cm-1，SNP吸收峰出现在1 154.55、1 078.03、1 019.26 cm-1以及761 cm-1附近的吸收峰主要是通过C=C伸缩振动而引起的。1 730 cm-1附近没有吸收峰表明SNP组成中不存在糖醛酸；在882、1 799 cm-1附近没有吸收峰，表明SNP组成中不存在呋喃糖。如图2-B所示，SNP的单糖组成为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖，摩尔比为6∶ 12∶63∶10∶5。

2.3 SNP对巨噬细胞RAW 264.7增殖活力的影响

从图3可以看出，SNP质量浓度除在所设置的4 000μg/mL外，其他设定浓度均可促进巨噬细胞RAW 264.7的增殖，且SNP质量浓度升高的条件下，增殖活力呈先升高后降低的趋势；当SNP质量浓度为250μg/mL时，巨噬细胞增殖活力最强。

2.4 SNP对巨噬细胞RAW 264.7细胞因子分泌量的影响

由图4可知，与对照组相比，SNP组及LPS组中NO、IL-6、TNF-α、IFN-β等细胞因子分泌量均显著或极显著升高（P<0.05或P<0.01)；SNP质量浓度为250μg/mL时分泌量最高，但各SNP组均弱于LPS的作用（P<0.05或P<0.01)。

2.5 TLR2抗体对SNP作用巨噬细胞RAW 264.7分泌细胞因子的影响

由图5可知，无论巨噬细胞RAW 264.7是否经TLR2抗体作用，与空白对照相比，SNP和LPS处理均极显著增加了NO、IL-6、TNF-α和IFN-β细胞因子的分泌量（P<0.01）。值得注意的是，与未加TLR2抗体组相比，LPS处理后各细胞因子分泌量极显著降低（P＜0.01）；而SNP处理尽管降低了各细胞因子分泌量，但除IL-6外差异均不显著；空白对照在抗体处理前后的吞噬细胞的细胞因子分泌量无显著差异。说明TLR2不是SNP的受体，SNP对巨噬细胞RAW 264.7细胞因子分泌量的影响不是通过TLR2受体调节的。

3 结论与讨论

许多研究表明，食用菌多糖具有免疫调节活性，是一种较好的天然免疫调节佐剂[23]。多糖的相对分子质量是其发挥免疫活性的重要条件[21]，本试验得到的SNP的分子质量为3.2×105u，属于活性多糖，具有免疫活性。食用菌多糖的免疫活性与其组成结构紧密相关，SNP的单糖是以摩尔比为6∶12∶63∶10∶5的阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖组成，高比例的葡萄糖和半乳糖使其能发挥较强免疫活性；红外光谱表明，SNP分子中含有的大量醇羟基等活性基团可以降低其在水中的黏度，增强其溶解性，增大其与作用基团的接触面积，从而使中性多糖的免疫效果增强。

巨噬细胞是免疫调节过程中对抗炎症的重要效应细胞，本研究发现，SNP在一定的浓度范围内可促进巨噬细胞增殖，当SNP质量浓度为250μg/mL时，巨噬细胞增殖活力最强，NO、IL-6、TNF-α、IFN-β的分泌量最高，与空白对照差异极显著（P＜0.01），但低于LPS处理的细胞因子分泌量，这与丁航等[24]发现的香菇多糖能刺激小鼠腹腔巨噬细胞活化，并使i NOS活性增加，释放大量NO；刘用国等[25]发现的250、500μg/mL短葶山多糖可不同程度地提高腹腔巨噬细胞吞噬能力、趋化作用和分泌IL-6、TNF-α；张琳[26]研究发现，琐琐葡萄多糖可激活巨噬细胞，促进TNF-α、IFN-β的释放的试验结果一致。说明当机体受到刺激时，可通过分泌多种细胞因子或者趋化因子发挥免疫作用，但是当SNP浓度过高时，产生了与较低浓度下不同的免疫调节活性，表明SNP呈现免疫调节的双向作用，这可能是因为适量多糖的免疫调节活性较强，而过量的多糖会刺激巨噬细胞失控性地释放多种炎性介质，抑制其免疫活性的发挥，从而导致其免疫功能的下降[22]。

TLR2可介导多糖作用于巨噬细胞分泌NO、IL-6、TNF-α、IFN-β等物质进行免疫调节[21]。本研究表明，SNP作用于TLR2抗体处理后的巨噬细胞RAW 264.7，其NO、TNF-α、IFN-β等细胞因子的分泌降低未呈现显著性，推测TLR2可能不是识别SNP的免疫受体，可能由于多糖是以多环节、多靶点的方式发挥免疫调节作用的[27]，当多糖的某一结构与不同的受体结合或某一受体与多糖的不同位点相结合时，其发挥的免疫作用不同；多糖不仅可以通过与受体结合促进巨噬细胞分泌细胞因子，还可以通过其他受体的介导促进巨噬细胞的清除功能，从而抑制细胞因子的产生[28]。此外，有研究表明，半乳糖呋喃酰基侧链在识别TLR2过程中显示潜在作用[28-29]，而SNP不存在呋喃糖结构，TLR2也可能作为配体辅助其他TLRs受体联合作用，从而发挥免疫功能，究竟SNP与哪个TLRs结合发挥免疫调节作用及具体的调节机制还有待进一步探讨。

综上所述，对广叶绣球菌经分离纯化得到的SNP由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖构成，摩尔比为6∶12∶63∶10∶5，分子质量为3.2×105u。SNP可通过调节NO、IL-6、TNF-α、IFN-β等细胞因子的分泌来促进巨噬细胞RAW 264.7的增殖，但这一作用不是通过TLR2受体介导。SNP发挥免疫调节作用的机制还有待进一步深入研究。