利用SSR创建中国北方黍稷资源DNA身份证

胡玉璐，姜百灵，陈 凌，王海岗，曹晓宁，王瑞云，乔治军

（1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 农业基因资源研究中心/农业农村部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室/杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，山西 太原 030031）

黍稷，又名为黍（Panicum miliaceumL.），是我国传统的粮食作物，抗旱能力极强，适宜栽种在干旱以及半干旱地区，在我国的北方尤其在西北地区非常适宜种植[1-3]。黍稷的栽种在我国旱作农业、盐碱地的开发利用和救灾补种中，发挥着十分重要的作用[4]。黍稷具有上万年的栽培历史，多篇历史文献资料曾记载黍稷栽种在我国发展上的重要性[5-6]。在当今日益追求健康饮食的社会生活中，杂粮因其膳食纤维丰富等原因倍受追崇，黍稷作为五谷杂粮之一，其营养成分丰富，不仅含有蛋白质、脂肪、维生素和矿物质元素等人体基本营养素，且这类营养素含量普遍高于小麦、大米等我们较常食用的谷类[7-8]。在近些年的研究中，人们认识到黍稷具有的营养价值很高，也能达到一定的保健功效，是较为经济、实惠、安全、有疗效的食疗食品，其开发的前景十分广阔[9]。

SSR（Simple sequence repeat，简单序列重复）分子标记法具有分布均匀、数量丰富、稳定性好、技术相对完善等优点，主要在物种的基因型鉴定与品种保护、种子的纯度评价和种质保存、分子标记辅助选择育种、资源鉴定等领域中应用。SSR标记也是目前应用较为广泛的遗传标记技术[10]，在花生[11]、花椰菜[12]、棉花[13]、高粱[14]等多种作物种质资源的遗传多样性分析中应用。SSR标记也能从DNA水平直接鉴定出品种之间的遗传差异[15]。国际植物新品种保护联盟（UPOV）利用SSR和SNP（Single nucleotide polymorphism，单核酸多态性）作为分子标记构建作物品种DNA指纹数据库[16]。SSR标记结合毛细管电泳技术，具有的高通量、高精度、高效率等优点，可用于大量材料的检测评定，在大豆[17]、玉米[18]、小麦[19]、水稻[20]、柑橘[21]、菜豆[22]等作物品种的DNA指纹数据库构建中应用。DNA条形码就是基于在SSR分子标记技术，将种间基因水平差异用数字转化成条形码的形式，使品种有一个由特定数字组成的代码，对种质资源的知识产权的保护和管理具有重要作用[23-25]。DNA条形码自2003年首次提出后，已在粮食作物（小麦和玉米等）、水果（苹果和桃等）和油料作物（芝麻、花生等）中广泛应用，使资源实现了数字化和网络化管理。

我国种质资源库已有黍稷资源9 885份，地方品种占99.4%，育成品种占0.6%，种质资源丰富，对黍稷资源的开发利用具有重大意义[26]。由于黍稷新资源的不断采集和引进，种质资源的交流越来越频繁，导致农产品品种、良种、地方品种和野生品种之间出现大量的同源异义现象，农家品种流通不足，无法发挥出优良品种的最大价值，造成种质资源严重浪费，极大地影响了资源的采集和整理效率[27]。因此，创建准确可靠且操作便捷的资源鉴定系统势在必行，需为黍稷品种制定一份专属的DNA分子身份证，以便更好的开发和利用黍稷种质资源[28]。在目前研究中，已有陆徐忠等[29]从48对SSR荧光引物中筛选出12对作为核心引物，构建了安徽省水稻品种127个分子指纹图谱。侯丽媛等[30]从16对荧光SSR引物中筛选出7对引物，构建了包括苹果新品种赤霞在内的20个品种的分子识别卡。黍稷作为一种小杂粮，其分子身份证的构建报道极少。将条形码引入黍稷资源管理，编辑黍稷资源信息，使其具有特定的数字编码，可以解决目前存在的问题，有助于保护种质资源的知识产权[31-33]。

本研究采用SSR分子标记法，选取中国北方具有代表性的20份黍稷材料，利用14对高基元引物，拟构建20份黍稷资源的分子身份证，为黍稷资源的高效分类和应用提供一定理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验选用中国北方大部分地区20份有显著差异的黍稷材料，山西省（2份）、陕西省（4份）、黑龙江（1份）、内蒙古（4份）、河南（1份）、宁夏（3份）、甘肃省（4份）、和青海省（1份）8个省共20份黍稷资源进行种植，于三叶期取叶片0.3 g，液氮速冻保存至-80℃冰箱。20份材料如表1所示。

1.2 试剂和仪器

试剂：氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇琼脂糖、0.5×TBE电泳缓冲液、6×DNA loading buffer、dd H2O、2×TaqPCR MasterMix含染料、30%的丙烯酰胺、TBE电泳缓冲液、过硫酸铵、TEMED、50 bp Marker、AgNO3、Na OH、甲醛CTAB裂解液。

仪器：离心机、冰箱、BIO-GENER、聚丙烯酰胺凝胶电泳仪、高压灭菌锅、高速冷冻离心机、基因扩增仪、涡旋仪、Nanodrop ND-1000核酸浓度检测仪、微波炉、琼脂糖凝胶电泳仪、Bio-Rad凝胶成像仪、移液枪。

1.3 试验方法

1.3.1 DNA提取和检测 剪取三叶期叶片，采用改良CTAB法[34]提取基因组DNA。利用NanodropND-1000核酸浓度检测仪检测DNA的浓度和纯度，用琼脂糖凝胶电泳以检测DNA的完整性[35]。

表1 20份黍稷试验材料Tab.1 The detail of 20 broomcorn millet accessions in this experiment

1.3.2 引物筛选、PCR扩增及产物检测 用14对高基元引物（表2）扩增地理来源差异较大的20份黍稷资源，筛选条带清晰、扩增稳定且多态性较高的引物用于构建分子身份证。20μL PCR体系含10μL 2×MasterMix（中 科 瑞 泰2×Taq PCR MasterMix含染料）、0.8μL正向引物、0.8μL反向引物、7.4μL dd H2O和1μL DNA模板。反应程序为94℃4 min；94℃40 s，退火温度40 s，72℃1 min，36个循环；72℃8 min[28]。

表2 SSR引物的序列及退火温度Tab.2 Sequence of SSR primers and annealing temperature

1.4 数据处理

根据PCR扩增条带的基因组数据，有条带读“1”，无条带读“0”。用PowerMarker 3.25[36]软件计算每个引物的多态性信息含量指数（PIC），用PopGen 1.32[37]计算不同样品间的Nei's遗传距离。利用东北农业大学开发的ID Analysis 4.0软件建立分子身份证。输入相应的字符串并使用联机条形码生成器（http://barcode.cnaidc.com/app/html/bcgcode128.php）产生DNA条形码；黍稷种质基本信息及身份证通过在线二维码输入技术（https://cli.im/）产生相应的DNA二维码。

2 结果与分析

2.1 试验SSR的引物筛选结果

从北方黍稷栽培区选取黍稷材料共20份，对五、六碱基引物共14对SSR引物筛选，结果表明，材料相似系数为0.8，缺失引物占比为50%。其中,有4对引物与其他引物相似系数过高，被剔除。10对引物能够扩增出条带清晰、稳定性好、多态性高的引物，可用于分子身份证的构建的核心引物。

2.2 引物多态性及遗传参数分析

用10对引物对20份黍稷种质进行了扩增。由表3可知，在20份材料的10个基因座中检测到30个等位基因，每个基因座中检测到3个等位基因（平均3.000 0）；有效等位变异（Na）为1.662 3（RYW7）~2.792 3（RYW12），平均为2.455 3；Shannon多样性指数（I）为0.702 9（RYW7）~1.088 0（RYW2），平均值为0.958 8；杂合度（Ho）为0.500 0（RYW7）~0.823 5（RYW12），平均值为0.686 6；期望杂合度（He）为0.411 3（RYW7）~0.686 2（RYW2），平均 值为0.602 4；Nei's的基因多样性指数（Nei）为0.398 4（RYW7）~0.659 8（RYW2），平均值为0.582 8；多态信息含量（PIC）在0.488 6（RYW3）~0.776 6（RYW8），平均值为0.629 8。

表3 10个SSR的遗传多样性参数Tab.3 Genetic diversity parameters of 10 SSR markers

2.3 北方栽培区黍稷的DNA分子身份证构建

本试验采用多个引物的等位基因组合来划分品种，获得分子身份证的引物为RYW10、RYW6、RYW7、RYW5、RYW1、RYW2、RYW8和RYW3共8对引物可将全部黍稷材料区分开来。将10对引物用排列组合方式构建DNA分子身份证的即字符串DNA分子身份证。各品种详细编码如表4所示，最终获得各品种的二维码和条形码表示其DNA分子身份证（图1）。以表4中编号1材料为例，其字符串DNA分子身份证为10111110，表示在上述引物顺序下材料1中在引物RYW10显示有条带、RYW6显示无条带、RYW7显示有条带，依次类推，到引物RYW3无条带，即黍稷材料1的字符串DNA分子身份。

表4 20份黍稷资源的分子身份证编码Tab.4 Code of molecular ID of 20 broomcorn millet resources

3 讨论

3.1 SSR遗传多样性衡量参数

黍稷是一种遗传变异多样的古老作物，已有大量相关研究。前人研究表明，黍稷基因多样性指数分别为0.736 0、0.768 6、0.628 4、0.841 5、0.847 8和0.859 9，多态性信息含量分别为0.554 4、0.457 3、0.427 9、0.587 4、0.471 4和0.566 7[25-26，35，38-40]。本研究对8个省的黍稷材料进行了分析，数据在其范围中。

3.2 DNA指纹图谱和分子身份证编码

DNA指纹是一种通过比较电泳指纹的差异来区分生物个体差异的方法。然而，由于DNA指纹图谱条带多，人工比对和解释费时费力，统计分析繁琐，限制了大规模物种鉴定的应用。DNA分子身份证是以前者为基础，采用不同的编码方法对电泳图进行数字化，得到字符串结果，并辅以条形码、二维码等科学的表示方法，使品种比对更加高效、方便、准确，克服了手工比对指纹繁琐、效率低下的缺点，广泛应用于品种鉴定。以往的研究利用SSR标记构建品种的分子识别卡，常用的编码方法有以下3种：0/1编码型，根据电泳条带有无，赋值1或0，形成0和1串[41]。等位基因分配编码型，编码扩增的等位基因[42]。基因型被指定为编码类型，引物扩增的条带被编码[24]。本研究采用第1种凝胶电泳法进行编码，具有编写简单、统计方便、字长适中、检索方便等优点。

3.3 PAGE银染法构建DNA分子身份证的可行性研究

到目前为止，检测SSR标记的方法主要有2种，即PAGE银染法和荧光毛细管电泳法。杨文娟等[43]用这2种方法检测了131份应用核心种质，PAGE银染法所得数据与毛细管电泳结果基本一致。另外，许多研究者对此进行了研究，试验结果对PAGE方法是肯定的。另外，常规变性PAGE银染法不需要昂贵的实验仪器，试剂成本低，适合于少量物质的分析。普通引物可以保存3~5 a，而荧光标记引物只能保存1~2 a，因此后者的合成成本远高于前者。因此，在引物质量可靠、试验材料少、经济条件有限的前提下，采用PAGE银染法构建DNA分子身份证是可行的。

3.4 用高碱度引物构建分子身份证

过去，低基元的SSR被用来构建资源的分子身份证。张嘉等[44]从111对引物中筛选出29对SSR核心引物，最终用4对双碱基引物构建了66个中国芍药分子识别卡。郭艳春等[45]结合高、低碱基引物构建分子身份证，用12对荧光SSR引物组合（1、4、4、1、2对单碱基、二碱基、三碱基、四碱基和五碱基）构建了61张黄麻核心种质分子身份证。本研究用8对高碱基（4碱基重复基序）引物检测了2个遗传多样性参数指标，即基因多样性指数1.043 7和多态性信息含量0.690 5，均高于低碱基[25，46]。

4 结论

本试验在14对SSR引物中筛选出10对适宜碱基引物对北方地区的20份黍稷种质进行鉴定，将北方地区的黍稷种质品种及其近缘野生种和育成品种的信息资料进行分类汇总，构建了20份糜子种质的条形码DNA分子身份证和二维码DNA分子身份证。