北方春糜子区糜子种质分子身份证的创建

王宇卓，王 柳，陈 凌，王海岗，王瑞云，，乔治军

（1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 农业基因资源研究中心/农业农村部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室/杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，山西 太原 030031）

糜子（Panicum miliaceumL.）属禾本科黍属，是干旱和半干旱等地区的重要的粮食作物之一，也是我国种植历史悠久的栽培作物之一[1-4]。在禾谷类作物中，粟类作物是除水稻、小麦、玉米、大麦、高粱外的第六大作物，养育着全世界1/3以上的人口[5]。全球糜子种质资源有20 000余份，我国有9 885份[6]。连帅等[7]对糜子的起源地相关研究表明，我国的蒙古高原地区、东北地区和黄土高原地区的糜子遗传相关性大，遗传多样性最丰富，阐明了我国是糜子作物的起源中心。我国也是糜子的主产国，目前主要种植在我国东北、华北、西北等干旱少雨地区[8]。糜子利用其发达的根系从深层土壤中吸收水分，通过茎和叶片上的绒毛和蜡质层减少水分的蒸发，充分运用有限的水热资源，避开旱季，短时间内完成并获得一定的产量。它能够适应各种不同的土壤，对贫瘠的土壤也有较强的适应能力，且耐干旱、耐盐碱，是荒漠地区的有力栽培作物之一[9-12]。由于其生育期短，也是重大灾后生态恢复的补救作物之一[13]。糜子营养丰富，籽粒中富含钙、铁、磷、钾、镁、锌以及人体必需氨基酸等，有明目安神、益阴利肺的功效。糜子在药用和食用领域发挥重要作用，可以加强脑细胞新陈代谢、恢复神经细胞功能、促进人体纤维再生、减缓人体衰老，也对脾胃虚弱、胃痛腹泻、肥胖症和心血管病等有一定的预防及治疗作用，可以有效避免老年性疾病的发生[14-16]。

我国糜子种质资源库9 885份资源中有8 515份收集于1957—2003年（98%来自我国，2%来自其他14个国家）。此外，地方品种和育成品种分别占99.4%和0.6%，拥有这些种质资源，对于深入研究糜子具有十分重要的意义[6]。但由于新资源的不断收集和引进，种质交流日趋频繁，农作物新品种的诞生也在日益发展，导致农家种、育成品种、地方品种及野生品种间同名异物和同物异名现象大量出现，影响了资源的收集整理效率，因此，寻找便捷分类记名的方法成为亟待解决的问题[17]。迄今，随着科学技术的不断发展，条形码和二维码成为大数据网络时代标记商品的便捷方式。相较于传统的形态鉴定方法，DNA条形码不受表型和发育时期的影响，通用性强、准确度高，操作标准化[18]。二维码技术有效容纳数字、字母、文字、图片等信息，可以被手机、电脑等电子设备全方位快速识别，使用范围广[19]。将条形码及二维码引入糜子资源管理，编辑糜子资源信息，使其拥有特定的数字代码，有助于保护种质资源知识产权[20-21]。2014年，吴劲松等[22]利用3条候选序列对白及属药用植物进行PCR扩增、测序以及序列分析，最终确定2种候选条形码可以作为鉴定白及属的DNA条形码。2015年，莫文娟[23]选取8个DNA片段提取泡桐属51份材料的DNA，进行PCR扩增及其产物直接测序，结果表明，有4个序列变异位点较多，可用于泡桐属的分类研究。2021年，李井干等[24]以龙树科的21份植物为材料，选用3条DNA条形码片段对其进行亲缘关系分析和分类鉴定，可将其进行明确的系统分类。2014年，陆徐忠等[25]以127份安徽水稻品种为试验材料，基于12对SSR荧光核心引物，结合品种商品信息构建了分子身份证。2020年，侯丽媛等[26]以苹果新品种赤霞为试验材料，从16对荧光SSR引物中筛选出7对，构建了20个栽培品种的分子身份证。2021年，樊晓静等[27]以103份茶树品种为供试材料，筛选出24个SNP位点，结合品种信息构建了分子身份证。糜子资源丰富，迄今分子身份证构建方面的报道极少。

本研究选取北方春糜子区的糜子种质共21份为材料，拟利用14对高基元引物构建21份资源的分子身份证，为糜子资源的高效管理和合理应用提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料共21份糜子资源，均来源于北方糜子区，包括山西大同（15份）、忻州（2份）和朔州（4份）（表1）。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取和检测 剪取三叶期糜子叶片，采用改良CTAB法[28]提取基因组DNA。利用Nano-drop ND-1000核酸浓度检测仪检测DNA的浓度和纯度，采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性[5]。

表1 21份糜子试验材料Tab.1 21 broomcorn millet accessions

1.2.2 引物筛选、PCR扩增及产物检测 用14对高基元引物（表2）扩增地理来源差异较大的21份糜子资源，筛选条带清晰、扩增稳定且多态性较高的引物用于构建分子身份证。20μL PCR体系含10μL 2×MasterMix（中科瑞泰2×Taq PCR Mas-terMix含染料）、0.8μL正向引物、0.8μL反向引物、7.4μL dd H2O和1μL DNA模板。反应程序为：94℃4 min；94℃40 s，退火40 s，72℃1 min，36个循环；72℃8 min[17]。用14对引物扩增糜子试验材料，如表2所示，14对引物的四碱基重复基元为：GGCC（1个）、CGGA（1个）、GGAA（1个）、AGGA（1个）、GCAG（1个）、TTTC（1个）、AGCG（1个）、TCCT（1个）、CAGC（1个）、GATG（1个）、GGAG（2个）、GCCT（1个）、TATC（1个）共13种，其中，GGAG数量较多。

表2 SSR引物的序列及退火温度Tab.2 Sequence of SSR primers and annealing temperature

1.3 分子身份证构建

根据电泳图片所示，将同一位置有扩增条带的记为1，否则记为0。利用PowerMarker 3.25和PopGen 1.32软件计算多态性信息含量指数（PIC），利用东北农业大学开发的资源特征分析软件ID Analysis 4.0建立字符串分子身份证。利用在线条形码生成器（http://barcode.cnaidc.com/app/html/bcgcode128.php）将对应字符串生成可扫描的条形码DNA分子身份证，再利用在线二维码生成器（https://cli.im/）生成二维码DNA分子身份证。

2 结果与分析

2.1 引物筛选

对14对高基元引物进行扩增，其中有6对引物与其他引物相似系数过高，被剔除，剩余8对引物扩增出条带清晰、稳定且多态性较高的引物（表3），可作为候选核心引物用于构建糜子资源分子身份证。

表3 8个SSR的遗传多样性参数Tab.3 Genetic diversity parameters of the 8 SSR markers

2.2 引物多态性及遗传参数分析

利用8对引物对21份糜子资源进行扩增，由表3可知，21份材料在8个位点共检测出24个观测等位变异，每一个位点均检出3个（平均3.000 0）；检出有效等位变异（Ne）为2.484 5~2.971 2，均值为2.596 2；Shannon多样性指数（I）为0.987 7~1.093 7，均值为1.000 1；观测杂合度（Ho）为0.526 3~0.833 3，均值为0.759 2；期望观测杂合度（He）为0.612 1~0.681 4，均值为0.625 8；Nei's基因多样性指数（Nei）为0.597 5~0.663 4，均值为0.609 5；多态性信息含量（PIC）为0.593 3~0.760 8，均值为0.620 3。8对引物均具有高度多态性（PIC＞0.5），可用于后续分子条形码及二维码的构建。

2.3 糜子种质的分子ID（条形码与二维码）的构建

21份糜子资源的字符串分子身份证如表4所示。

表4 21份糜子资源的字符串分子身份证Tab.4 Character string molecular ID cards of 21 broomcorn millet accessions

利用ID Analysis 4.0软件检测14对引物，结果发现与其他引物相似系数过高的引物有6对（RYW2、RYW3、RYW4、RYW7、RYW13和RYW14），因此将其剔除。利用剩余的8对引物组合（RYW9、RYW10、RYW8、RYW12、RYW6、RYW5、RYW11和RYW1）可将全部糜子材料区分，进而构建了21份材料的字符串DNA分子身份证（表4）。

根据PCR扩增条带的数据，有条带读“1”，无条带读“0”。以表4中材料1为例，其字符串DNA分子身份证为11101011，表示在上述引物顺序下，材料1在引物RYW9、RYW10、RYW8下均显示有条带，在引物RYW12下显示无条带，依次类推，到引物RYW1显示有条带。将各糜子字符串DNA分子身份证输入条形码生成器中，生成条形码DNA分子身份证，将各糜子的名称、统一编号、生态区、来源、身份证号、备注等信息输入在线二维码生成器中可得到21份糜子材料的二维码身份证（图1）。

3 结论与讨论

近年来，对糜子的遗传多样性研究较多。连帅等[7]对不同地区的糜子地方品种和野生资源的遗传多样性进行了分析。刘敏轩等[29]研究发现，国内野生资源的遗传多样性高于国外。王璐琳等[30]利用6份地域差异显著的糜子对70个SSR标记进行多样性筛选，共筛选出17个具有多态性的位点，为进行遗传多样性分析奠定了基础。2017年，王瑞云等[31]利用85个高基元SSR检测96份糜子资源，其基因多样性指数和多态性信息含量分别为0.770 8和0.472 3，均低于本研究结果，这与研究材料以及样本数量差异有关。张枭等[32]对沈阳山楂圃内保存的48份国家种质资源进行了遗传多样性分析，其中多样性指数为0.582，多态性信息含量为0.447，均低于本研究，这与试验SSR和作物有关。

DNA指纹图谱存在谱带多、人工对比费时费力、统计分析繁琐等缺点，难以实现批量鉴定[33-34]。而DNA分子身份证是在此基础上加以改进，采用不同的编码方式对电泳图谱进行数字化处理获得字符串，再将字符串转换成条形码对内容进行表述，此方法高效准确，已广泛用于种质资源鉴定[35]。高源等[36]对部分苹果种质资源进行了分子身份证的构建。目前利用SSR标记构建品种分子身份证有3种编码方法：第1种是0/1代码类型，此方法是根据电泳条带的有无赋值1或0，形成0/1字符串[37]；第2种是等位基因赋值编码类型，编码扩增的等位基因[38]；第3种是基因型赋值编码类型，编码扩增带型[39]。本试验采用第1种方法，获得的字符串长度适中，方便检索。

目前SSR标记的检测方法有2种，分别是PAGE银染法和荧光毛细管电泳法，杨文娟等[40]用上述2种方法检测了131份应用核心种质，比较分析后发现对于多态性带较少、条带间分子量差异大及扩增带型清晰的引物，PAGE银染法获得的数据和毛细管电泳结果基本吻合。此外，还有许多研究人员对此进行了研究，试验结果均对PAGE法表示肯定。此外，常规的变性PAGE银染检测法不需要昂贵的试验仪器且试剂成本低廉，适用于分析少量材料。普通引物能够保存3~5 a，而荧光标记的引物只能保存1~2 a，因此，后者的合成成本远远高于前者。因此，在拥有可靠的引物质量、较少试验材料以及经济条件有限等前提下，采用PAGE银染法来构建DNA分子身份证是可行的。本试验采用的SSR分子标记技术，重复基因短，对DNA要求不高，有丰富的多态性，且重复性优良，被广泛应用于对群体进行遗传结构的分析和遗传图谱的构建[41]。此外，在基因定位[42]、检测种子纯度[43]、品种鉴定[44]、研究亲缘关系的远近[45]等方面也有广泛的应用。

以往研究多使用低基元SSR构建资源的分子身份证。2016年，张嘉等[46]从111对引物中筛选出了29对（二、三碱基分别为28、1对）SSR核心引物，最终利用4对二碱基引物构建了66个我国芍药的分子身份证。2021年，郭艳春等[19]把高、低基元引物相结合构建分子身份证，利用12对荧光SSR引物组合（单、二、三、四、五碱基分别为1、4、4、1、2对）构建了61份黄麻（Corchorus capsularisL.）核心种质的分子身份证。同年，张枭等[32]利用14对分子标记，在SSR指纹图谱的基础上形成每份山楂资源的条形码即分子身份证，以区分48份山楂材料。

本试验对21份来源于北方春糜子生态区的糜子材料用14对高基元SSR引物扩增，从中筛选出8对核心引物，可以扩增出凝胶电泳条带，在基于DNA指纹图谱的基因型上构建分子身份证号，能被机器准确快速识别的21份DNA条形码和二维码，实现糜子资源管理的科学化和规范化。