不同泌乳期牛奶矿物元素特征及产地溯源研究

马宇轩 谢立娜 谭丽芹 梁克红 赵姗姗 郄梦洁 胡翔宇 赵 燕,*

(1中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/农产品质量安全重点实验室，北京 100081；2内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特 010018；3辽宁省北票市长皋农业技术推广站，辽宁 北票 122000；4 农业农村部食物与营养发展研究所，北京 100081)

牛奶作为高营养价值食品，富含矿物元素，对人体健康有积极作用。导致牛奶中营养元素含量出现差异的因素有物种[1-3]、地区来源[4-5]及泌乳期[6-7]等。随着中国经济的快速发展，乳制品行业取得了巨大进步，市场需求量也不断增加。然而，三鹿奶粉事件和特仑苏牛奶“OMP”事件的爆发不仅严重影响了中国的乳制品行业发展，而且严重损害了人民的利益。当乳制品出现问题时，可通过产地溯源技术跟踪乳制品生产，追踪其来源，确定其真实性，进而确保人民的利益。因此，建立乳制品产地溯源模型可以有效保障乳制品的安全及真实性，保护消费者合法权益。

矿物元素分析是确定农产品产地的一种有效方法。近年来，矿物元素技术在橄榄油[8]、梨[9]、牦牛肉[10]等多种农产品中用于追溯产地来源。国内外已开展了大量针对乳制品产地溯源的研究[11-14]。Vatavali等[15]、谭凯燕等[16]及Necemer等[17]通过测定乳及乳制品中矿物元素含量，对不同来源的乳及乳制品进行了有效判别。由此说明，矿物元素对不同来源的乳及乳制品具有良好的鉴别能力。除了乳类的产地来源，泌乳期也可能影响乳类中矿物元素的含量[18-20]。Miciński等[21]及Malacarne等[22]通过测定乳中矿物元素含量，发现不同矿物元素在不同泌乳阶段含量不同。综上，国内外基于矿物元素技术的泌乳期及产地溯源研究，大多针对奶酪及特种家畜乳等样品，相关研究的样本量及矿物元素测定较少，不同研究对泌乳期阶段有不同划分，导致不同泌乳阶段对样品中矿物元素的含量影响不同。此外，产地不同导致同规格或者同类型的牛奶价格产生较大差异，易出现掺假、造假及以次充好等相关安全问题。

本研究初步探讨泌乳期3个阶段对牛奶中12种元素(钠、镁、钾、钙、钛、铬、锰、铁、镍、锌、锶和钼)含量的影响。在此基础上，利用矿物元素含量区分我国不同地区的牛奶样品。通过方差分析和偏最小二乘判别分析法对数据进行分析，并根据交叉验证结果区分牛奶样品的来源。最后，在确定牛奶样品来源后获得影响产地溯源的关键重要性因子(variable importance in the projection, VIP)。本研究利用矿物元素含量分析研究泌乳期不同阶段及不同产地对牛奶中营养成分的影响，建立牛奶的产地溯源模型，以期为牛奶在泌乳期不同阶段的研究提供思路及基础数据参考，并为牛奶产地溯源研究提供理论依据，以保障乳制品安全及真实性，保护广大消费者合法权益。

1 材料与方法

1.1 样品采集

从4个地区(河北、宁夏、陕西和内蒙古)收集泌乳期3个不同阶段(早期：30～90 d，中期：120～180 d，末期：210～270 d)牛奶样品，并在-20℃条件下冷冻。分别从每个省的每个泌乳期各采集10个乳样，每个乳样50 mL，共计120个样品。牛奶样品的地理信息如表1所示。

表1 牛奶样品地理信息表

1.2 材料与试剂

硝酸(色谱纯)、氟化氢(色谱纯)、甲醇(色谱纯)，美国Fisher Scientific；其余试剂均为分析纯。所用水均为超纯水。标准物质为奶粉(GBW 10017)和鸡肉(GBW 10018)，中国地质科学院地球物理地球化学勘查研究所。

1.3 仪器与设备

防腐烘箱，青岛济科实验仪器有限公司；7500系列电感耦合等离子体质谱仪，美国安捷伦科技公司；H1850 台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司。

1.4 样品制备及测定

将50 g牛奶样品(鲜重)在-20℃条件下冷冻，然后将其在冷冻干燥机中冷冻干燥24 h并研磨成细粉。将冻干的牛奶置于离心管中，并以1∶5(g·mL-1)的固液比加入氯仿∶甲醇溶液(2∶1)，振动10 min，然后以5 000 r·min-1的速度离心5 min，用移液管移去上清液，重复此过程2次。离心管用穿孔薄膜密封，放在通风橱中过夜。将样品冻干并研磨均匀，将0.2 g脱脂干物质称重放置到15 mL聚四氟乙烯消化罐中，向罐中加入0.6 mL硝酸和2 mL氟化氢，在150℃的防腐烘箱中消化12 h后打开盖子，在120℃的防腐电热板上将酸蒸发至接近干燥。将2 mL硝酸加入罐中，并将其置于150℃的防腐烘箱中12 h。最后，将消化罐内的溶液转移到50 mL容量瓶中，用超纯水定容，并通过0.45 μm无机过滤器进行分析。用电感耦合等离子体质谱仪对12种元素(钠、镁、钾、钙、钛、铬、锰、铁、镍、锌、锶和钼)进行分析。用奶粉和鸡肉标准物质校准牛奶样品的元素值，对每个样品进行3次分析，并使用外部标准分析进行量化，所有结果均表示为3次测量的平均值。内部标准包括锗、钇、铑和铂，用于确保仪器的稳定性。每当内标物的相对标准偏差高于5%时，重新测量样品。

1.5 数据分析

用SPSS 22.0软件进行数据分析。对矿物元素进行方差分析，当差异显著时，进行Duncan多重比较以确定区域间的显著差异，使用线性判别分析(linear discriminant analysis, LDA)评价矿物元素值对不同样品来源的判别效果。利用SIMCA 14.1软件进行偏最小二乘判别分析(partial least-squares discriminant analysis, PLS-DA)以区分不同产地的牛奶样品，并通过计算矿物元素的重要性以确定影响产地溯源的关键重要性因子。

2 结果与分析

2.1 泌乳期不同阶段牛奶矿物元素含量差异比较

泌乳期的3个阶段(早期:30～90 d，中期:120～180 d，末期:210～270 d)中12种矿物元素(钠、镁、钾、钙、钛、铬、锰、铁、镍、锌、锶和钼)的含量见表2。同一泌乳期，常量元素中含量最高的是钾(16 281～16 922 mg·kg-1)，最低的是镁(1 182～1 255 mg·kg-1)。微量元素含量最高的是铁(70.5～74.8 mg·kg-1)，最低的是铬(107～119 μg·kg-1)。经方差分析，12种矿物元素在泌乳期不同阶段的含量差异不显著(P>0.05)。表明在这3个泌乳阶段中，泌乳期对牛奶中的矿物元素含量无影响。

表2 不同泌乳阶段牛奶中12种矿物元素含量

2.2 不同产地牛奶矿物元素含量差异比较

图1显示4个地区牛奶样品中12种矿物元素(钠、镁、钾、钙、钛、铬、锰、铁、镍、锌、锶和钼)的含量。方差分析结果表明，除钼外，其余11种矿物元素在4个地区的牛奶样品中均存在差异。宁夏地区牛奶样品中钠、镁、钾、钙、铁及镍6种矿物元素含量高于其他3个地区；内蒙古地区的牛奶样品中钛、铬、锰和锌含量显著高于其他3个地区；陕西和内蒙古的牛奶样品中锶含量差异不显著，但显著高于其他2个地区。河北地区牛奶样品中钠、镁、钾、钛、铬、锰、铁、镍及锶元素含量显著低于其他3个地区；河北和宁夏地区牛奶样品中锌含量差异不显著，但显著低于其他2个地区；陕西和内蒙古地区样品钙含量差异不显著，但显著低于其他2个地区。4个地区牛奶中含量最高的常量元素是钾(12 898～22 871 mg·kg-1)，最低的是镁(879～1 610 mg·kg-1)；河北、宁夏及陕西3个地区牛奶含量最高的微量元素是铁(62～84 mg·kg-1)，内蒙古地区牛奶含量最高的微量元素是锌(75 mg·kg-1)，4个地区含量最低的微量元素是铬(44～176 μg·kg-1)。

注：图中不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.3 基于化学计量学的牛奶产地判别分析

为区分不同产地的牛奶样品，根据12种矿物元素含量进行偏最小二乘法分析，结果如图2所示。4个地区的牛奶样品分别聚类且彼此分离，说明通过矿物元素含量可以区分4个地区的牛奶样品。4个地区牛奶样品的分类及验证结果见表3。总体正确分类和交叉验证的准确率结果分别为95.8%和88.3%，说明利用矿物元素技术可以对这4个地区的牛奶样品进行有效判别。用SIMCA 14.1软件进一步对4个地区牛奶样品进行分析，获得分类矿物元素的重要性因子(图3)。结果表明，牛奶中的锶、铬、锌及锰4种矿物元素是具有较高贡献的重要性因子(>1)，因此可以通过测定上述4种矿物元素识别河北、宁夏、陕西和内蒙古4个地区牛奶样品的来源。

图2 4个地区牛奶样品的PLS-DA图

图3 4个地区牛奶样品分类矿物元素的重要性因子

表3 4个地区牛奶样本的分类和正确验证结果

3 讨论

在本研究中，选择泌乳期的3个阶段(早期:30～90 d，中期:120～180 d，末期:210～270 d)对牛奶中的12种矿物元素含量进行检测，结果表明泌乳期不同阶段中的牛奶矿物元素特征不具有差异性，与前人研究结果不同[18, 23]，但与Aumeistere等[24]报道的结果相似，这可能是由于泌乳期阶段的划分不同导致对矿物元素含量的影响不同，也可能是由于品种或物种差异造成的影响不同[25]。本研究中同一泌乳期含量最高的常量元素是钾，最低的是镁[18]，微量元素含量最高的是铁，与孟庆翔[26-27]对肉牛饲料中的矿物元素含量研究结果一致。

在前期研究基础上，本试验研究了地区对牛奶中矿物元素含量的影响，结果表明不同产地可显著影响牛奶中矿物元素含量，与高玎玲[28]及郭秀秀[29]的研究结果一致。本研究中宁夏地区牛奶样品的钠和钾含量高于其他3个地区，这可能与奶牛的饲养方式有关[30]。虽然微量元素(钛、铬、锰、铁、镍、锌、锶及钼)在体内的含量较低，但可通过奶牛的饮食与饮水转移到牛奶中，而奶牛的饮食及饮水与当地的地质和土壤特征有关[31]。Chen等[32]对全国29个省、市及自治区22种土壤环境元素的背景值进行研究调查，发现宁夏地区土壤中镁、钙及镍元素的含量明显高于内蒙古、河北及陕西地区，与本研究中牛奶矿物元素在以上不同地区的含量结果一致。

虽然国内外基于矿物元素技术的乳制品产地溯源研究相对较多[33-35]，但大多集中于欧洲地区，且多数是针对奶酪进行产地溯源研究，关于牛奶的产地溯源研究相对较少[36]。本研究利用矿物元素技术并通过偏最小二乘判别分析法，对牛奶样品进行产地溯源，结果显示对4个地区有良好的区分效果，说明牛奶中矿物元素的含量具有独特的产地环境特征，可作为牛奶产地溯源的重要变量参数。4个地区的牛奶样品分类及判别结果显示原始分类准确率为95.8%，交叉验证准确率为88.3%，说明矿物元素技术可以有效鉴别牛奶样品的来源。通过计算4个地区12种矿物元素的重要性因子筛选出鉴别牛奶样品产地的关键重要性因子(锶、铬、锌及锰)，这4种矿物元素反映了奶牛生长的地域地理状态，其含量与4个地区奶牛生长的地域及饮水环境密切相关[37-39]，是识别河北、宁夏、陕西及内蒙古地区牛奶样品的指示因子，代表着这4个牛奶产地的矿物指纹特性，尤其是饮水环境，4个地区饮用水中的锶元素含量远高于国家标准[37-38，40]，奶牛通过饮水影响牛奶中的锶含量，与周雪巍[41]的研究结果一致。综上所述，产地对乳品中的矿物元素含量有影响，且乳品中的矿物元素特征具有地域差异性，因此可以利用矿物元素技术结合化学计量学判别模型对牛奶进行产地溯源。

4 结论

本研究结果表明泌乳期3个阶段(早期:30～90 d，中期:120～180 d，末期:210～270 d)不影响牛奶中12种矿物元素的含量，不同泌乳阶段的划分对矿物元素含量的影响不同，在同一泌乳阶段中，钾元素含量最高，铬元素含量最低；而4个不同的地区(河北、宁夏、陕西及内蒙古)则影响牛奶中除钼元素外的11种矿物元素(钠、镁、钾、钙、钛、铬、锰、铁、镍、锌及锶)含量。此外，本研究在牛奶的产地溯源研究中获得了良好的交叉验证结果，并得到了锶、铬、锌和锰4个可以判别河北、宁夏、陕西及内蒙古牛奶样品的关键重要性因子。说明利用矿物元素技术结合化学计量学判别模型对牛奶进行产地溯源是可行的，这为牛奶的矿物元素数据库及产地溯源研究提供了有价值的参考数据，也为牛奶在泌乳期不同阶段的研究提供了相关思路。