注射用丹参多酚酸通过调节Akt/mTOR通路介导的自噬对氧糖剥夺/再灌注Neuro-2a细胞凋亡的影响

张雯琪，李东娜，马萌萌，徐杨杨，王少峡，柴丽娟, 3，郭 虹, 3*，胡利民, 3*

注射用丹参多酚酸通过调节Akt/mTOR通路介导的自噬对氧糖剥夺/再灌注Neuro-2a细胞凋亡的影响

张雯琪1，李东娜1，马萌萌2，徐杨杨1，王少峡1，柴丽娟1, 3，郭 虹1, 3*，胡利民1, 3*

1.天津中医药大学省部共建组分中药国家重点实验室，天津 301617 2.兵器工业北京北方医院，北京 100089 3.方剂学教育部重点实验室天津市中药药理学重点实验室，天津 301617

研究注射用丹参多酚酸（Salvianolate Lyophilized Injection，SLI）对氧糖剥夺/再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）损伤小鼠脑神经瘤细胞株Neuro-2a的保护作用及机制。体外培养Neuro-2a细胞，建立OGD/R损伤模型，给予SLI（10、25、50 μg/mL）以及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）干预，检测SLI对OGD/R损伤Neuro-2a细胞存活率、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）漏出量及细胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）的释放；采用流式细胞仪检测细胞凋亡率；采用Western blotting法检测凋亡及自噬相关蛋白的表达情况。与OGD/R组比较，SLI显著提高OGD 4 h/R 24 h Neuro-2a细胞存活率（＜0.05、0.01），降低LDH漏出量（＜0.05、0.01），抑制细胞凋亡和细胞内Cyt-C释放（＜0.05、0.01），调节活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved cystein-asparate protease，cleaved Caspase-3）、B淋巴细胞瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白表达（＜0.05、0.01）。SLI还可以增加OGD 4 h/R 6 h细胞自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3II，LC3Ⅱ）、自噬效应蛋白（Beclin-1）表达（＜0.05、0.01），减少自噬选择性底物p62蓄积（＜0.05、0.01）。加入自噬抑制剂，可以抵消SLI对OGD/R损伤Neuro-2a细胞的保护及凋亡抑制作用。此外，SLI可以降低磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）水平以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）表达（＜0.05、0.01），介导细胞自噬的发生。SLI对OGD/R损伤后的Neuro-2a细胞具有保护作用，其机制可能是通过调节Akt/mTOR信号通路介导的细胞自噬，进而发挥抑制细胞凋亡的作用。

注射用丹参多酚酸；氧糖剥夺/再灌注；Neuro-2a细胞；自噬；凋亡；蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路

缺血性脑卒中是一种常见的脑血管疾病，不仅严重影响人们的身心健康，而且给家庭和社会带来巨大经济负担。以往研究表明，缺血性脑卒中以氧化应激、炎症反应和血管通透性增加等各种病理和生理变化为特征[1-2]。近来研究表明，细胞自噬和凋亡可同时参与缺血性脑卒中的发病机制，并且两者之间存在相互作用[3]。

细胞自噬是一种分解代谢过程，是真核细胞中存在的重要现象。越来越多的证据表明，自噬参与了缺血性脑卒中的发生和发展，而且细胞自噬和凋亡参与相同的通路，由此形成了一个复杂的网络。在大鼠缺血再灌注的早期过程中，激活自噬可以为脑缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）诱导的损伤提供一定的神经保护作用[4]。在新生大鼠缺氧模型中，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抑制剂雷帕霉素治疗后，可以诱导自噬并发挥对大鼠的神经保护作用[5]。自噬还可以通过抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cystein-asparate protease，Caspase）依赖性途径来阻断细胞凋亡的诱导，从而减轻细胞损伤[6]。因此，自噬的激活可能成为治疗缺血性卒中的潜在方向。然而，自噬是一把“双刃剑”。在某些特殊情况下，过度自噬可能导致细胞凋亡增加，在缺血性卒中的进展中发挥有害作用[7]。自噬可以与细胞凋亡同时发生，或自噬可能首先占主导地位，但最终会导致自噬相关的细胞发生凋亡[8]。总之，自噬和细胞凋亡之间的相互作用和串扰是复杂而重要的。因此，缺血性脑卒中后如何干预自噬的发展是组织修复和功能恢复的关键。

注射用丹参多酚酸（Salvianolate Lyophilized Injection，SLI）是从丹参中提取的水溶性物质，临床主要用于治疗轻中度缺血性脑卒中[9-11]。Chen等[12]研究表明SLI中含有的主要成分为多种丹酚酸，主要包括原儿茶醛、丹酚酸B、丹酚酸Y、丹酚酸D、丹酚酸E、精酸和迷迭香酸的非对映异构体，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等药理作用。本课题组前期研究证实，SLI对大鼠脑缺血再灌注损伤具有明显保护作用，其可能与减轻氧化应激、抑制炎症反应有关[13-14]。目前关于SLI如何调节自噬和凋亡以及SLI诱导的自噬和凋亡之间的相互作用的报道较少。因此，本研究旨在揭示SLI对氧糖剥夺/再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）诱导小鼠脑神经瘤细胞株Neuro-2a自噬和凋亡的影响，并进一步探讨细胞自噬和凋亡之间的关系。

1 材料

1.1 细胞

Neuro-2a细胞株购自北京协和医学院。

1.2 药品与试剂

SLI（批号20151004，0.13 g/支，含丹参多酚酸100 mg、辅料甘露醇30 mg，国药准字Z20110011）由天津天士力之骄药业有限公司提供；MEM培养基（批号SH30024.01）、青霉素、链霉素（批号SV30010）购自美国Hyclone公司；CCK-8检测试剂盒（批号CK04）购自日本同仁化学研究所；胎牛血清（批号10099141C）、胰蛋白酶（批号25200056）、D-Hank’s（批号13150016）购自美国Gibco公司；Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）凋亡检测试剂盒（批号A13199）购自美国Invitrogen公司；RIPA细胞裂解液购自北京索莱宝科技有限公司；BCA测定试剂盒（批号23227）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；Immobilon Western 化学发光HRP底物（批号WBKLS0500）、PVDF膜（批号03010040001）购自美国Millipore公司；微管相关蛋白1轻链3Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3Ⅱ，LC3Ⅱ）抗体（批号ab48394）、p62抗体（ab56416）、B淋巴细胞瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）抗体（批号ab27795）购自英国Abcam公司；自噬效应蛋白（Beclin-1）抗体（批号3738）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）抗体（批号4060）、Akt抗体（批号4685）、mTOR抗体（批号2983）、β-actin抗体（批号4970）、cleaved Caspsase-3抗体（批号9664）购自美国CST公司；HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（批号ZB-2301）、HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体（批号ZB-2305）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；CytoTox-ONETMHomogeneous Membrane Integrity Assay购自美国Promega公司；自噬抑制剂3-MA购自美国Sigma公司；细胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）检测试剂盒购自武汉基因美生物科技有限公司。

1.3 仪器

FORMA3111型CO2恒温培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；64R型低温高速离心机（美国Beckman Coulter公司）；TE200型倒置相差显微镜（日本Nikon公司）；Station 3型多功能读板机（美国MolecularDivices公司）；BD FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司）；PowerPac™ Basic电泳仪、Mini-PROTEAN®Tetra Cell Systems电泳槽、Trans-Blot®SD System半干转仪（美国Bio-Rad公司）；Milli-Q Advantage A10，超纯水系统（美国Millipore公司）。

2 方法

2.1 OGD/R模型的建立

OGD/R模型按照本课题组前期方法建立[15]。将处于对数生长期的Neuro-2a细胞消化并吹打成单细胞悬液，调整细胞密度至4×105个/mL接种于96孔板中。待Neuro-2a细胞生长至80%～90%融合时进行实验，弃去培养基后以D-Hank’s溶液洗涤细胞3次，换成D-Hank’s平衡盐溶液置于充满95% N2、5% CO2混合气体的缺氧小室氧糖剥夺孵育4 h，再灌注时置换为完全培养基，放置于常规细胞培养箱继续培养0、6、12、24 h以建立OGD/R模型。

2.2 分组与给药

根据前期实验结果，设置对照组、OGD/R组、OGD/R＋SLI（10、25、50 μg/mL）组[16-18]及OGD/R＋3-MA＋SLI（50 μg/mL）组和OGD/R＋3-MA组。

2.2.1 对照组 将完全培养基替换为MEM培养液，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养4 h后置换为完全培养基孵育0、6、12、24 h。

2.2.2 OGD/R组 将完全培养基替换为D-Hank’s平衡盐溶液，置于充满95% N2、5% CO2混合气体的缺氧小室孵育4 h，然后置换为完全培养基孵育0、6、12、24 h。

2.2.3 OGD/R＋SLI（10、25、50 μg/mL）组 将完全培养基置换为含有不同浓度SLI的D-Hank’s溶液，置于充满95% N2、5% CO2混合气体的缺氧小室孵育4 h后，然后分别置换为含有不同浓度SLI的完全培养基孵育0、6、12、24 h。

2.2.4 OGD/R＋3-MA＋SLI（50 μg/mL）组 将完全培养基置换为含有2.5 mmol/L 3-MA的完全培养基提前孵育1 h，1 h时后置换为含有50 μg/mL SLI、2.5 mmol/L 3-MA的D-Hank’s溶液，置于充满95% N2、5% CO2混合气体的缺氧小室孵育4 h，然后置换为含有50 μg/mL SLI的完全培养基孵育24 h。

2.2.5 OGD/R＋3-MA组 将完全培养基置换为含有2.5 mmol/L 3-MA的完全培养基提前孵育1 h，1 h后置换为含有2.5 mmol/L 3-MA的D-Hank’s溶液，置于充满95% N2、5% CO2混合气体的缺氧小室孵育4 h，然后置换为完全培养基孵育24 h。

2.3 SLI对OGD/R诱导的Neuro-2a细胞存活率和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）漏出量的影响

2.3.1 细胞存活率的测定 Neuro-2a细胞悬液以1×106/mL接种于96孔板中，培养至细胞贴壁生长均匀，即可用于实验。各组细胞加入药物干预后，弃去上清液，每孔加入100 μL含有10% CCK-8的MEM培养基，37 ℃避光孵育30 min后，使用多功能酶标仪测定450 nm处的吸光度（）值。

2.3.2 LDH漏出量的测定 按“2.3.1”项下方法处理细胞，每孔收集细胞上清液25 μL，转移至新的96孔板中，加入预先配制好的CytoTox-ONETMReagent，20 ℃孵育30 min，加入终止液50 μL，摇晃混合30 s，测定560 nm/590 nm值。

2.4 SLI对OGD/R诱导的Neuro-2a细胞凋亡的影响

按“2.3.1”项下方法处理细胞，Neuro-2a细胞经胰蛋白酶消化后，用冷的PBS洗涤，然后重悬于150 μL含有5 μL Annexin-V-FITC和1 μL PI的混合缓冲液中。37 ℃避光孵育15 min后，通过流式细胞仪定量荧光强度。正常活细胞不会被染色，凋亡细胞可被标记上Annexin V，坏死和凋亡晚期细胞可被Annexin V和PI同时染色。

2.5 SLI对OGD/R诱导的Neuro-2a细胞Cyt-C释放的影响

各组加入药物干预后，收集Neuro-2a细胞并洗涤2次。使用Cyt-C检测试剂盒测定Cyt-C释放。

2.6 SLI对OGD/R诱导的Neuro-2a细胞凋亡及自噬相关蛋白表达的影响

Neuro-2a细胞悬液以1×106/mL接种在6孔板中，培养至细胞贴壁生长均匀，各组细胞加入药物处理后，弃去培养基，用冷的D-Hank’s平衡缓冲盐溶液清洗3次，每孔加入100 μL含1%蛋白酶抑制剂PMSF的细胞裂解液，于冰上孵育10 min，收集裂解液，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液，用BCA法测定蛋白浓度，再加入Loading Buffer煮沸变性。蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入4%脱脂奶粉，室温封闭1.5 h，分别加入cleaved Caspsase-3（1∶1000）、Bcl-2（1∶1000）、LC3II（1∶1000）、Beclin-1（1∶1000）、p62（1∶1000）、p-Akt（1∶2000）、Akt（1∶1000）、mTOR（1∶1000）和β-actin（1∶1000）抗体，4 ℃孵育过夜后，用TBST缓冲液洗涤5次，每次5 min；加入HRP标记的山羊抗小鼠/兔IgG抗体（1∶10 000），室温孵育1 h，用TBST缓冲液洗涤5次，每次5 min。最后用化学发光成像系统进行显影。采用Image J软件分析各目的蛋白的灰度值，用于计算各目的蛋白的表达。

2.7 统计学处理

数据采用SPSS 23.0和GraphPad Prism 5.0统计软件进行分析，数据用表示，组间比较采用单因素方差（One-Way ANOVA）中的Tukey检验进行分析。

3 结果

3.1 SLI对OGD/R诱导的Neuro-2a细胞形态、存活率及LDH漏出量的影响

如图1-A所示，倒置显微镜下可以观察到，对照组Neuro-2a细胞呈多边形，贴壁生长良好，细胞密度大，胞体饱满；OGD/R组细胞稀疏，贴壁性差，胞体明显皱缩；OGD/R＋SLI（10 μg/mL）组细胞形态有所改善，轮廓相对融合；OGD/R＋SLI（25、50 μg/mL）组细胞形态较OGD/R组有明显改善，轮廓融合，细胞贴壁性良好。如图1-B、C所示，与对照组比较，OGD/R组细胞存活率明显降低（＜0.01），细胞上清液中LDH漏出量明显升高（＜0.01）；与OGD/R组比较，OGD/R＋SLI（25、50 μg/mL）组细胞存活率显著升高（＜0.05、0.01），OGD/R＋SLI（10、25、50 μg/mL）组细胞上清液中LDH漏出量均显著降低（＜0.05、0.01）。表明SLI可以改善OGD/R诱导的Neuro-2a细胞损伤，且呈剂量相关性。

与对照组比较：##P＜0.01 ###P＜0.001；与OGD/R组比较：*P＜0.05 **P＜0.01，下图同

3.2 SLI对OGD/R诱导的Neuro-2a细胞凋亡的影响

如图2所示，与对照组比较，OGD/R组细胞凋亡率、Cyt-C释放量以及cleaved Caspase-3蛋白表达水平显著升高（＜0.01、0.001），Bcl-2蛋白表达水平显著降低（＜0.01）；与OGD/R组比较，OGD/R＋SLI（25、50 μg/mL）组细胞凋亡率、Cyt-C释放量以及cleaved Caspase-3蛋白表达水平均显著降低（＜0.05、0.01），Bcl-2蛋白表达水平显著升高（＜0.05、0.01）。表明SLI在神经元OGD/R过程中具有保护作用，可减轻OGD/R损伤诱导的细胞凋亡，说明SLI具有抗细胞凋亡的特性。

A-Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡 B-各组细胞凋亡率 C-各组细胞Cyt-C释放量 D-各组细胞cleaved Caspase-3和Bcl-2蛋白表达

3.3 SLI对OGD/R诱导的Neuro-2a细胞自噬相关蛋白表达的影响

如图3-A所示，与对照组相比，缺氧4 h后细胞LC3II蛋白表达已经出现显著降低（＜0.05），复氧后6 h达到最低点（＜0.01）。因此，进一步评估了SLI对OGD 4 h/R 6 h自噬蛋白表达的影响。如图3-B所示，与对照组比较，OGD/R组细胞LC3II和Beclin-1蛋白表达水平显著降低（＜0.01），p62蛋白表达水平显著升高（＜0.01）；与模型组比较，OGD/R＋SLI（10、25、50 μg/mL）组LC3II蛋白表达水平均可显著升高（＜0.05、0.01），p62蛋白表达水平均可显著降低（＜0.05、0.01）；OGD/R＋SLI（50 μg/mL）组Beclin-1蛋白表达水平显著升高（＜0.01）。表明SLI能够通过提高自噬水平发挥对OGD/R损伤Neuro-2a细胞的保护作用。

3.4 SLI通过激活自噬抑制OGD/R诱导的Neuro-2a细胞凋亡

如图4所示，与对照组比较，OGD/R组细胞存活率显著降低（＜0.01），LDH漏出量、细胞凋亡率以及Cyt-C释放量均明显升高（＜0.01）；与OGD/R组比较，OGD/R＋SLI（50 μg/mL）组细胞存活率显著升高（＜0.01），LDH漏出量、细胞凋亡率和Cyt-C释放量均显著降低（＜0.01）。但加入自噬抑制剂3-MA后，与模型组相比，细胞存活率、LDH漏出量、细胞凋亡率和Cyt-C释放量没有明显变化，但与OGD/R＋SLI（50 μg/mL）组比较有显著性差异（＜0.01）。说明加入自噬抑制剂3-MA后，药物未能对凋亡细胞发挥保护作用，从而表明自噬的激活可能在SLI介导的凋亡抑制中发挥关键作用。

A-缺氧4 h后，复氧0、6、12、24 h细胞LC3II蛋白表达情况 B-缺氧4 h后，复氧6 h各组细胞LC3II、Beclin和p62蛋白表达情况

A-各组细胞存活率 B-各组细胞LDH漏出量 C-Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡 D-各组细胞凋亡率 E-各组细胞Cyt-C释放量 与SLI 50 μg·mL−1组比较：&&P＜0.01

3.5 SLI通过调控Akt/mTOR信号通路抑制OGD/R诱导的Neuro-2a细胞凋亡

随后又检测了细胞内Akt的磷酸化水平及mTOR的表达。如图5所示，与对照组比较，OGD/R组细胞Akt磷酸化水平及mTOR蛋白表达水平均显著升高（＜0.01、0.001）；与模型组比较，OGD/R＋SLI（10、25、50 μg/mL）组Akt磷酸化水平均显著降低（＜0.05、0.01），OGD/R＋SLI（25、50 μg/mL）组mTOR蛋白表达水平显著降低（＜0.05）。提示SLI可能通过抑制Akt/mTOR活性提高自噬水平，从而发挥对OGD/R损伤Neuro-2a细胞的保护作用。

图5 SLI通过调控Akt/mTOR信号通路抑制OGD/R诱导的Neuro-2a细胞凋亡(, n = 3)

4 讨论

缺血性脑卒中是一种严重的脑血管疾病，是指脑血管狭窄或闭塞，最终导致脑组织缺氧甚至坏死[19]。中医认为缺血性中风属于血瘀证范畴，“活血化瘀”是最常用的治疗方法，而丹参是“活血化瘀”最常用的药物之一，且丹参类制剂对心脑血管系统有较好作用[20]。SLI是利用冷冻干燥法从丹参水溶性提取物中分离得到，在我国临床上已广泛用于治疗急性缺血性脑卒中。本课题组前期研究显示，SLI可以促进脑缺血/再灌注（middle cerebral artery occlusion/ reperfusion，MCAO/R）损伤或糖尿病模型中风后大鼠神经功能的恢复，其机制可能与减少氧化应激、抑制炎症反应和增强血脑屏障功能有关[21-23]。然而，其潜在的作用机制尚不完全清楚，需要进一步研究。因此，本研究在Neuro-2a细胞中建立OGD/R模型探索了SLI的保护机制，并且证明了SLI对OGD/R诱导的Neuro-2a细胞损伤具有一定的神经保护作用，其可以通过激活Akt/mTOR依赖的自噬途径减少神经元凋亡。

细胞凋亡是继发性损伤的重要机制，并且在脑I/R损伤期间显著加重[24]。在凋亡过程中，Cyt-C从线粒体膜间隙释放到胞质中，随后招募并导致Caspase级联反应。最终，Caspase-3被活化，导致细胞凋亡[25]。Bcl-2家族主要参与线粒体介导的凋亡途径[26]，是一种主要的抗凋亡蛋白。本研究通过流式细胞术检测发现SLI明显降低了OGD/R诱导Neuro-2a细胞的凋亡率，抑制了Cyt-C的释放，降低了cleaved Caspase-3的表达，并上调了Bcl-2蛋白表达水平，证明SLI在体外具有抗凋亡作用。

越来越多的证据支持自噬的调节是脑I/R损伤的一种机制。Luo等[27]发现，通过激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/Akt途径抑制自噬有助于防止缺血损伤引起的神经元死亡。相反，Yu等[28]提出适度激活自噬可以通过调节mTOR增加海马神经元的自噬，减少再灌注损伤，保护神经元。关于自噬在缺血性卒中中的作用存在相互矛盾的报道，这可能与损伤程度和时间有关。因此，自噬在缺血性脑卒中是有益还是有害仍有待进一步讨论。本研究发现自噬水平随着复氧时间的延长先降低后升高，并在复氧24 h后恢复到正常水平。也就是说，自噬在脑缺血早期被激活，这与之前的报道一致[29]。本研究发现SLI可以激活OGD/R诱导的Neuro-2a细胞自噬，增加LC3Ⅱ和Beclin-1的表达，减少p62的积累，并最终提高细胞存活率。总之，SLI在体外表现出明显的自噬保护作用。

许多应激途径依次引发神经细胞内的自噬和凋亡，它们之间的相互作用复杂但意义重大。Luo等[30]证实自噬可能通过减少凋亡相关分子表达而表现为抗凋亡机制。然而，He等[31]研究表明，凋亡激活通常与自噬增加有关。在许多情况下，自噬先于凋亡。Sirois等[32]观察到自噬早于细胞凋亡的发展，并在细胞凋亡被激活时持续发生。在本研究中，自噬抑制在复氧6 h时处于最低点，然后逐渐升高，复氧24 h细胞凋亡率明显高于对照组。这表明自噬先于凋亡发生，与文献中的报道一致。本研究的局限性在于没有对凋亡进行时间相关性分析，并且对自噬检测仅持续到复氧24 h，自噬是否会继续上升并导致过度自噬尚不清楚。但SLI能够明显逆转OGD/R诱导的自噬抑制和凋亡的发生，而且SLI激活自噬的时间早于抑制凋亡的时间。此外，当自噬抑制剂3-MA抑制自噬时，SLI提高细胞存活率、减少细胞凋亡和Cyt-C释放的能力减弱，表明SLI可以通过上调自噬抑制细胞凋亡。

PI3K/Akt/mTOR信号通路是经典的自噬通路。mTOR是自噬的主要负调节因子，位于PI3K/Akt通路的下游。研究显示，神经营养因子的神经保护作用是通过皮层神经元中的PI3K/Akt/mTOR通路由自噬介导的[33]。同时，PI3K/Akt/mTOR通路是细胞内关键的信号转导通路，可促进细胞生长并抑制细胞凋亡[34]。基于该途径，体外观察了OGD/R处理后，给予SLI的Neuro-2a细胞中p-Akt和mTOR的表达。结果表明，SLI可以下调p-Akt和mTOR的表达，从而促进自噬。这表明SLI对缺血性卒中的神经保护作用可以通过Akt/mTOR通路调节自噬活性。但是，Akt/mTOR信号通路并不是调节自噬的唯一通路，为了进一步阐明SLI是否可以调节Akt通路，可以使用Akt磷酸化抑制剂Ly294002在后续研究中进行验证。

本研究主要探索了OGD/R诱导Neuro-2a细胞后自噬与凋亡的关系，并研究了Akt/mTOR信号通路在调控Neuro-2a细胞中的作用。发现SLI通过诱导自噬和抑制细胞凋亡来改善OGD/R诱导的损伤，并通过Akt/mTOR依赖性途径发挥神经保护作用。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Salvianolate Lyophilized Injection induced autophagy against neuronal apoptosis through Akt/mTOR pathway in Neuro-2a cells

ZHANG Wen-qi1, LI Dong-na1, MA Meng-meng2, XU Yang-yang1, WANG Shao-xia1, CHAI Li-juan1, 3, GUO Hong1, 3, HU Li-min1, 3

1.State Key Laboratory of Component-based Chinese Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China 2.Beijing Northern Hospital of Weaponry Industry, Beijing 100089, China 3.Key Laboratory of Pharmacology of Traditional Chinese Medical Formulae, Ministry of Education, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China

To study the protective effect and mechanism of Salvianolate Lyophilized Injection (注射用丹参多酚酸, SLI) on oxygen-glucose deprivation/reperfusion (OGD/R)-injured mouse brain neuroma cell line Neuro-2a.Neuro-2a cells were cultured, OGD/R injury model was established, SLI (10, 25, 50 μg/mL) and autophagy inhibitor 3-methyladenine (3-MA) ​​were administered for intervention.Effects of SLI on survival rate, lactate dehydrogenase (LDH) leakage and cytochrome C (Cyt-C) release of OGD/R-injured Neuro-2a cells were detected; Apoptosis was detected by flow cytometry; Expressions of apoptosis and autophagy-related proteins were detected by Western blotting.Compared with OGD/R group, SLI significantly increased the survival rate of Neuro-2a cells induced by OGD 4 h/R 24 h (< 0.05, 0.01), decreased the leakage of LDH (< 0.05, 0.01), inhibited cell apoptosis and Cyt-C release (< 0.05, 0.01), regulated cleaved cystein-asparate protease (cleaved Caspase-3) and B lymphoma-2 (Bcl-2) protein expressions (< 0.05, 0.01).SLI increased the expressions of autophagy-associated protein microtubule-associated protein 1 light chain 3II (LC3II) and autophagy effector protein (Beclin-1) in cells induced by OGD 4 h/R 6 h (< 0.05, 0.01), reduced the accumulation of autophagy-selective substrate p62 (< 0.05, 0.01).The addition of an autophagy inhibitor could counteract the protective and apoptosis inhibitory effects of SLI on OGD/R-injured Neuro-2a cells.In addition, SLI could reduce the level of phosphorylated protein kinase B (p-Akt) and expression of mammalian target of rapamycin (mTOR) (< 0.05, 0.01) to mediate autophagy.SLI has a protective effect on Neuro-2a cells after OGD/R injury, its mechanism may be regulating the autophagy mediated by Akt/mTOR signaling pathway, thereby inhibiting apoptosis.

Salvianolate Lyophilized Injection; oxygen-glucose deprivation/reperfusion; Neuro-2a cells; apoptosis; autophagy; protein kinase B/mammalian target of rapamycin pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2022)09 - 2706 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.09.013

2022-01-18

国家自然科学基金资助项目（81573644）；国家重点科技攻关项目（2012ZX09101202）

张雯琪（1996—），女，硕士研究生，主要从事中药药理学相关研究。E-mail: 17622738901@163.com

通信作者：郭 虹（1983—），博士生导师，主要从事中药脑血管及神经药理研究。E-mail: cacti1983@163.com

胡利民（1966—），博士生导师，主要从事脑血管药理研究。E-mail: huliminth@126.com

[责任编辑 李亚楠]