不同产地杭白菊中绿原酸、木樨草苷、异绿原酸含量分析

牛广东

联勤保障部队第九八八医院 开封院区，河南 开封，475004

菊花为菊科植物菊(Chrysanthemum morifoliumRamat.)的干燥头状花序，主产于安徽歙县、屯溪、滁州、亳州，浙江桐乡，江苏射阳，湖北麻城，山东嘉祥，河南武陟，河北安国等7个省10个县(市)[1]。菊花的传统加工炮制方式有蒸制、炒制、酿制、酒制、浆制、阴干、烘干，现代一般采用的加工方式是烘房干燥、热风干燥等[2]。按产地及加工方式的不同，菊花可分为“亳菊”“滁菊”“贡菊”“杭菊”和“怀菊”五大品种。杭菊经产区长期栽培，分化为杭白菊和杭黄菊两种类型。杭白菊产量大，有较强的保健养生功效；杭黄菊近年来种植很少[3-4]。杭菊道地产地浙江桐乡主要栽培的杭菊为杭白菊，共有三个品种:湖菊(D.morifolium“Huju”)，小白菊(D.morifolium“Xiaobaiju”)，大白菊(D.morifolium“Dabaiju”)。小白菊的栽培最多，又被称为“小洋菊”。

菊花始载于《神农本草经》:“味苦平，主诸风头眩，肿痛目欲脱泪出，皮肤死肌，恶风湿痹，久服利血气，轻身耐老延年”。现代研究表明菊花中的活性成分包括黄酮、挥发油、多糖、有机酸、三萜等[5-7]。本文以绿原酸、异绿原酸、木樨草苷为指标，采用高效液相色谱方法对市场上购买的10批杭白菊药材进行检验。

1 仪器、试剂与材料

1.1 仪器及试剂

高效液相色谱系统(LC-20AT 液相色谱输液泵、CTO-10AS柱温箱、SPD-20A 紫外检测器、LCSolution色谱数据处理系统，日本岛津)，AB135-S电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司，瑞士)，KQ-500DB超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。绿原酸(批号18071907，成都普菲德生物技术有限公司)，木樨草苷(批号:19070302，成都普菲德生物技术有限公司)，异绿原酸(批号:18121001，成都普菲德生物技术有限公司)，色谱纯乙腈、甲醇、磷酸均为分析纯。

1.2 样品

菊花1号(产地:浙江桐乡，批号:200102，浙江良一药业股份有限公司)，菊花2号(产地:浙江，批号:20200108，泌阳县玉坡农业专业合作社)，菊花3号(产地:浙江，批号:190304010，湖南省博世廉中医药有限公司)，菊花4号(产地:浙江，批号:A200203，湖北金贵中药饮片有限公司)，菊花5号(产地:浙江，批号:191250481，康美药业股份有限公司)，菊花6号(产地:浙江，批号:A200411，湖北金贵中药饮片有限公司)，菊花7号(产地:浙江，批号:A190507，湖北金贵中药饮片有限公司)，菊花8号(产地:浙江，批号:200202，亳州市张仲景中药饮片有限责任公司)，菊花9 号(产地:安徽黄山，批号:190601)，菊花10号(产地:亳州中强，批号:180701)。

2 方法

2.1 供试品溶液的制备

取菊花粉末(过一号筛)约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中；精密加入70%(v/v)甲醇25 m L，密塞，称定重量；超声处理(功率300 W，频率45 k Hz)40 min，放冷，再称定重量；用70%(v/v)甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取绿原酸、木樨草苷、异绿原酸对照品适量，用70%(v/v)甲醇制成绿原酸浓度为32 mg/L、木樨草苷浓度为25 mg/L、异绿原酸浓度为84 mg/L的对照品混合溶液。

2.3 色谱条件

采用Merk Purosher RP-18 e(4.6 mm×250 mm，5μm)测定方法，流动相A 为乙腈，流相B 为0.2%(m/m)磷酸水溶液。梯度洗脱:0～10 min A为10%～15%；10～40 min A 为15%～25%；40～60 min A 为25%。流速0.8 m L/min，检测波长348 nm，柱温30 ℃，进样量10μL，理论塔板数不低于8 000。

2.4 含量测定

取菊花1号到10号样品，分别按第2.1节中方法制备供试品溶液，按第2.3节中所记录的色谱条件进行测定。

3 结果与分析

3.1 线性关系考察

精密吸取第2.2 节中对照品溶液0.5、1、2、3、5、10、15μL 注入高效液相色谱仪，根据第2.3节中所记录的色谱条件测定，记录各色谱峰峰面积，以绿原酸、木樨草苷、异绿原酸进样量(μg)为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，计算回归方程(见表1)。结果显示:绿原酸在0.016～0.48μg范围内，峰面积和浓度有良好的线性关系；木樨草苷在0.012 5～0.375μg范围内，峰面积和浓度有良好的线性关系；异绿原酸在0.042～1.26μg范围内，峰面积和浓度有良好的线性关系。

表1 线性关系考察结果

3.2 精密度试验

取第2.2节中混合对照品溶液，精密吸取，注入高效液相色谱仪中，连续进样6次；按第2.3节中所记录的色谱条件测定，记录各色谱峰峰面积。计算得:绿原酸峰面积的RSD=0.2%，木樨草苷峰面积的RSD=0.5%，异绿原酸峰面积的RSD=0.9%。可知，实验所用仪器的精密度较好。

3.3 重复性试验

精密称取同一批菊花粉末供试品，按第2.1节中方式制备6份供试品溶液，按第2.3节中所记录的色谱条件测定，记录各色谱峰峰面积。计算得:绿原酸含量的RSD=0.2%，木樨草苷含量的RSD=0.3%，异绿原酸含量的RSD=0.2%。可知，该方法的重复性较好。

3.4 稳定性试验

精密吸取第2.1节中同一供试品溶液，依次在0、2、6、12、18、24 h时向高效液相色谱仪中进样；按第2.3节中所记录的色谱条件测定，记录各色谱峰峰面积。计算得:绿原酸峰面积的RSD=1.2%，木樨草苷峰面积的RSD=1.7%，异绿原酸峰面积的RSD=0.4%。可知，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

3.5 加样回收率试验

采用加样回收法，精密称取已知含量的同一供试品6份，分别精密加入混合对照溶液适量，精密吸取10μg，向高效液相色谱仪中进样，按“2.3”中所记录的色谱条件测定，记录各色谱峰峰面积，计算绿原酸、木樨草苷、异绿原酸的平均加样回收率，绿原酸的平均加样回收率为99%、木樨草苷的平均加样回收率为99%、异绿原酸的平均加样回收率为99%，RSD 绿原酸为2.6%，RSD 木樨草苷为1.7%，RSD异绿原酸为1.2%，均在允许范围内，此方法准确度良好，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果

3.6 含量测定

取市售10批菊花样品，分别按第2.1节中方法制备供试品溶液，精密吸取，注入高效液相色谱仪；按第2.3节中所记录的色谱条件测定。结果见表3。

从表3可看出，10批菊花药材中活性成分绿原酸的平均含量为0.29%、木樨草苷的平均含量为0.53%、异绿原酸的平均含量为1.37%。《中国药典》2020版一部中[8]要求，菊花中所含绿原酸含量不得少于0.2%、木樨草苷含量不得少于0.080%、异绿原酸含量不得少于0.70%。市售的10批杭白菊药材中，大多数菊花的绿原酸含量在0.2%～0.3%左右，8号和10号样品中的绿原酸含量最高，分别为0.42%和0.45%；9号样品的绿原酸含量最低，为0.18%，未达到《中国药典》2020 版一部的要求，可判定为不合格药材。木樨草苷的含量大多在0.25%～0.35%左右，10 号样品中木樨草苷的含量最高(2.6%)；异绿原酸含量大多在0.8%～1.5%左右，8号和10 号样品中的异绿原酸含量最高，分别为2.26%和2.6%，2号和3号样品的异绿原酸含量最低，分别为0.82%和0.83%。综上可看出:10批菊花中，除9号样品外，其余厂家的菊花药材中绿原酸、木樨草苷和异绿原酸均达到了《中国药典》2020年版的要求。其中以亳州中强的10号样品质量最好，其次是浙江的8号样品，其他样品质量相近。

表3 含量测定结果

4 讨论

不同柱温、不同检测波长对实验结果的影响较大，本实验在20～40℃柱温之间根据分离效果选择了30 ℃柱温为色谱条件；在200～400 nm 检测波长之间根据色谱峰大小，选择了348 nm 检测波长为色谱条件，实际实验过程中，发现目标峰与杂质峰分离度不符合要求，所以调整流动相的组成和洗脱程序，确定乙腈-0.2%磷酸水溶液流动相。