血清外泌体miR-125b、miR-21及miR-122对肝细胞癌诊断价值*

王路，王魁，银花，叶莎，王娜

(新疆巴音郭楞蒙古自治州人民医院a.医学检验科，b.介入科，新疆库尔勒 841000)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是癌症致死的主要原因之一[1]，由于其发病隐匿、致死率高[2]，故而寻找诊断HCC的生物学标志物至关重要。微小RNA(microRNAs，miRNAs)可以通过调控癌基因和抑癌基因的表达，参与肿瘤细胞的形成、发展及转归等生物学过程[3]。外泌体中的miRNAs相对稳定，能更好地反映机体中的表达水平，因此被许多学者所关注[4]。有文献报道，miR-125b可以作为肿瘤抑制因子诱导HCC发生中的细胞衰老和凋亡[5]。外泌体miR-21可以通过多种方式调节抑癌基因PTEN和PTENp1的表达，影响HCC细胞的生长[6]。miR-122的过表达可以抑制HCC细胞的增殖[7]。miR-375在缺氧条件下通过靶向缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor -1α, HIF-1α)削弱HCC细胞的侵袭能力[8]。这几种miRNA均被报道与HCC高度相关。因此，本研究旨在检测HCC患者血清外泌体miR-125b、miR-21、miR-122及miR-375的表达水平，以期更进一步探讨其对HCC的诊断价值，并预测miR-125b潜在调控靶基因，有助于深入探究肝癌发展的调控机制。

1 资料与方法

1.1研究对象 收集2019年6月至2021年8月新疆巴音郭楞蒙古自治州人民医院介入科就诊的患者。肝癌患者46例(HCC组)，男32例，女14例，年龄50.5～67.5岁，中位年龄53岁。其中，早期18例，晚期28例，慢性乙型肝炎(CHB)患者11例(CHB组)。HCC诊断依据国家卫生健康委办公厅发布的《原发性肝癌诊疗指南(2017年版)》[9]。纳入标准：(1)有HBV感染，至少每隔6个月进行1次超声检查及血清甲胎蛋白(AFP)检测，发现肝内直径≤2 cm结节，多参数MRI、动态增强CT、超声造影或肝细胞特异性对比剂Gd-EOB-DTPA增强MRI 4项检查中至少有2项显示动脉期病灶明显增强、门脉期和/或延迟期肝内病灶强化低于肝实质即“快进快出”的肝癌典型特征，则可明确肝癌诊断；对于发现肝内直径>2 cm结节，则上述4种影像学检查中只要有1项典型的肝癌特征，即可以临床诊断肝癌。(2)有HBV感染，随访发现肝内直径≤2 cm结节，若上述4种影像学检查中无或只有1项检查有典型的肝癌特征，可以进行肝病灶穿刺活检或每2～3个月的影像学检查随访并结合血清AFP水平以明确诊断；对于发现肝内直径>2 cm的结节，上述4种影像学检查无典型的肝癌特征，则需要进行肝病灶穿刺活检或每2～3个月的影像学检查随访并结合血清AFP水平明确诊断。(3)有HBV感染，如血清AFP升高，特别是持续升高，进行影像学检查，若上述4种影像学检查中只要有1项检查有典型的肝癌特征，即可临床诊断为肝癌。具备以上任何一条即可纳入病例组，患者未经任何外科手术或介入治疗。排除标准：排除妊娠、生殖系胚胎源性肿瘤、活动性肝病、胆管细胞癌、混合型肝癌及转移性肝癌，且HCC患者血液样本均在患者行外科手术或介入治疗之前采集。收集各组研究对象的基本信息及临床相关资料，包括性别、年龄、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、α-L-岩藻糖苷酶(AFU)、AFP等，其中ALT、AST、AFU、AFP等项目均于我院检验科生化室检测。选择同期体检健康者50例作为健康人对照组。本项研究经过新疆巴音郭楞蒙古自治州人民医院伦理委员会批准(批准文号：bzrmyy201900011)，所有研究对象均知情同意。

1.2主要仪器及试剂 Zetasizer Nano ZS纳米粒度电位仪(英国Malvern公司)，BD Accuri C6小型流式细胞仪(美国BD公司)，7500型PCR扩增仪(美国ABI公司)。外泌体提取纯化试剂盒(上海宇玫博生物科技公司)，PCR引物及试剂、miRcute血清/血浆miRNA提取分离试剂盒、miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒(北京天根生化科技公司)。

1.3血清外泌体的分离及鉴定 采用无抗凝剂真空采血管采集各研究对象肘前静脉血5 mL(初次诊断确诊后第2天早晨空腹采集)，静置15 min，3 000×g离心15 min，在生物安全柜内用RNase加样枪头吸取1 000 μL的血清转移至1.5 mL RNase离心管中，置于-80 ℃低温冰箱保存备用。采用外泌体提取纯化试剂盒提取血清外泌体，按照操作说明书进行。将提取的外泌体样本送往广州市锐博生物科技公司进行鉴定。

1.4外泌体miRNA检测 按照miRcute血清/血浆miRNA提取分离试剂盒说明书提取血清外泌体(400 μL)中的miRNA，采用miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒对提取的外泌体miRNA进行逆转录。以cel-miR-39为外参照，利用miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒，进行qPCR扩增。miRNA检测外参，目录号：CR100-01,工作液浓度为1 μmol/L;外参引物，目录号：CD200-01,工作液浓度为10 μmol/L;引物has-miR-125b-5p,目录号：CD201-0047,工作液浓度为10 μmol/L;引物has-miR-21-5p,目录号：CD201-0092,工作液浓度为10 μmol/L;引物has-miR-122-5p,目录号：CD201-0006,工作液浓度为10 μmol/L;引物has-miR-375,目录号：CD201-0173,工作液浓度为10 μmol/L。PCR反应条件：95 ℃预变性15 min;95 ℃ 20 s,65 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，共5个循环；94 ℃ 20 s,60 ℃ 34 s,共45个循环。PCR总反应体系为20 μL，包括200 nmol/L上、下游引物各0.4 μL，2×miRcute Plus miRNA PreMix 10 μL，cDNA 2 μL，无菌ddH2O补足体积。各外泌体miRNA的相对表达水平以2-ΔΔCt法计算，公式:ΔΔCt=(实验组Ct目的基因-实验组Ct内参基因)-(对照组Ct目的基因-对照组Ct内参基因)。每组设3个复孔，重复3次。

1.5miR-125b基因预测 基于miRTarBase.V8、TarBase.V8、miRecords数据库[10-12]预测miR-125b的潜在调控靶基因，并通过clusterProfiler软件[13]分析与miR-125b具有潜在调控关系的靶基因，以间接推测其可能参与的信号转导通路。

2 结果

2.1各研究对象的临床资料 HCC组和健康人对照组、CHB组患者性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)，而ALT、AST、AFU和AFP在各组间的差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组研究对象各指标的表达水平

2.2血清外泌体的鉴定 使用BD Accuri C6小型流式细胞仪分析外泌体表面特异性标记蛋白CD63和CD81的阳性率，其值分别为54.7%和59.3%(图1A)。采用Zetasizer Nano ZS纳米粒度电位仪分析外泌体的粒子分布系数(PDI)，证实其值在0.08～0.70之间，体系分散度适中，粒径在20～200 nm范围的外泌体约占94%(图1B)。

注：A，外泌体表面特异性标记蛋白CD63和CD81的阳性率，FSC代表前向角，SSC代表侧向角，Count代表数量，FL1-A代表FITC信号强度，FL3-A代表PE信号强度；B，外泌体的粒径大小符合已报道外泌体特性，横坐标代表粒径(nm)，纵坐标代表百分比。

2.3血清外泌体miR-125b、miR-21、miR-122及miR-375的表达水平 与健康人对照组、CHB组相比，HCC组miR-125b、miR-21及miR-122的表达水平上调(P<0.05)，而miR-375的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

注：A～D，与健康人对照(Health)组及CHB组相比，HCC组血清外泌体miR-125b、miR-122及miR-21的表达显著上调；ns,miR-375的表达差异无统计学意义;*，P<0.05，***，P<0.001，****，P<0.000 1。

2.4HCC患者血清外泌体miRNA、AFP及AFU诊断效能分析 将HCC患者作为HCC组，健康对照人群和CHB患者作为非HCC组，绘制ROC曲线。根据Youden指数最大原则，确定cut-off值，并计算其AUCROC、敏感性、特异性，评估miRNA、AFP、AFU单独及联合检测对HBV相关HCC的诊断效能。结果表明，ROC曲线分析miR-125b、miR-21、miR-122、miR-375、AFP及AFU对HBV相关HCC的诊断效能、95%可信区间(CI)分别为0.900(95%CI:0.836～0.964)、0.857(95%CI:0.785～0.929)、0.827(95%CI:0.739～0.915)、0.597(95%CI:0.483～0.712)、0.881(95%CI:0.805～0.957)、0.733(95%CI:0.631～0.835)。miR-125b+AFP、miR-125b+miR-21、miR-125b+miR-21+AFP联合诊断效能分别可提高至0.927(95%CI:0.877～0.977)、0.919(95%CI:0.867～0.970)和0.941(95%CI:0.899～0.982)。见表2、图3。

表2 miRNA、AFP、AFU单独及联合检测的诊断效能

注：A，miR-125b、miR-122、miR-21、miR-375、AFP及AFU单独检测对HBV相关HCC的诊断效能；B， miR-125b、miR-21及 AFP联合检测对HBV相关HCC的诊断效能。

2.5miR-125b潜在调控靶基因预测结果 基于miRTarBase.V8、TarBase.V8、miRecords数据库(图4A)，最终获得9个与miR-125b具有潜在调控的靶基因(图4B)。进一步进行通路分析显示，miR-125b直接或间接参与p53信号通路、癌症中的miRNA、细胞衰老、转化生长因子(TGF)-β信号通路以及HCC等信号通路等(图4C)。

注：A，圆紫色、圆蓝色、圆绿色、红色三角分别代表miRTarBase.V8+miRecords数据库、miRTarBase.V8+TarBase数据库、TarBase.V8+miRecords数据库、miRTarBase.V8+TarBase.V8+miRecords数据库分析出的miR-125b潜在调控的靶基因；B，miRTarBase.V8、TarBase.V8、miRecords数据库分析出的miR-125b潜在调控靶基因的Venn图；C， clusterProfiler软件推测出的miR-125b直接或间接参与的信号通路。

3 讨论

我国是乙肝大国，故而在我国针对肝癌的筛查诊断十分重要[14]。AFP是临床常用的肝癌诊断标志物，但在如孕妇、畸胎瘤、重症肝炎等患者中，AFP水平亦可增高，而约有50%～70%的肿瘤直径<2 cm的肝癌患者的AFP指标在参考范围内[15]。

本研究发现肝癌患者血清外泌体miR-125b的表达水平显著高于健康人群，这与Giray等[16]报道的结果相同。笔者推测，当肝细胞受到损害后，肝细胞在不断损伤、修复的过程中发生癌变，此时miR-125b被外泌体包裹不断释放入血，故而血清外泌体miR-125b的表达水平显著上调。研究证实，血清外泌体miR-21可作为HCC诊断的生物学标志物，并在肿瘤发生、发展中起关键作用。在本研究中，HCC患者与健康人群相比，其血清外泌体miR-21的表达上调，这与Wang等[17]报道的外泌体miR-21在HCC患者体内高表达的结果一致。早期研究表明， miR-122作为肿瘤抑制因子，在肝癌患者血清外泌体中的含量减少[18]，而最近有报道称，miR-122在肝癌患者中的表达上调[18]。本研究结果表明，与健康人对照组和CHB组相比，HCC患者miR-122的表达上调。miR-122在血清外泌体中高表达可能归因于肿瘤组织向血液中的释放量增加。miR-375被研究证实是一种抑癌基因，其可靶向抑制SMAD7基因(TGF-β家族信号转导通路的抑制分子)，从而抑制肿瘤细胞[19]。而在本次肝癌的研究中，相对于健康人群，肝癌患者血清外泌体miR-375未见明显差异。

本研究还发现肝癌患者与健康人群相比，血清外泌体miR-125b、miR-21、miR-122、AFP和AFU的表达水平增加。笔者进一步绘制ROC曲线以评估该指标对HCC的诊断效能，结果发现单指标miR-125b的诊断效能优于传统AFP，而miR-125b和AFP两者联合检测，其AUCROC可增加至0.927。miR-125b、miR-21和AFP三者联合检测的AUCROC可提升至0.941。

在本次研究的4种miRNA中，miR-125b在肝癌和健康人群间的表达差异最为显著，其对肝癌的诊断效能亦最好，因此,笔者进一步利用生物信息学对miR-125b靶基因进行了预测，结果显示miR-125b可能与TP53INP1、BAK1、CEBPG、E2F3、ERBB2、ERBB3、NTRK3、SMO、SGPL19个靶基因有关。有文献报道，TP53INP1表达的缺乏可导致肿瘤发生的增加，且TP53INP1在晚期和转移性HCC患者中的表达显著下调[20]，间接提示miR-125b可作为肝癌的转移指标[21]，但具体机制需进一步的研究验证。对miR-125b可能参与的信号转导通路进行预测的结果显示，miR-125b直接或间接参与p53信号通路、癌症中的miRNA、细胞衰老、TGF-β信号通路等。有学者称，HCC的进展与STAT3诱导TGF-β的表达并抑制P53的表达有关，然而其并未进行更深一步的机制研究[17]。miR-125b与上述信号通路在HCC中的表达有待于进一步研究。

综上所述，HCC相关肝癌患者血清外泌体miR-125b、miR-122、miR-21的表达水平显著升高，且与AFP联合检测可提高肝癌的诊断效能，三者有望成为肝癌诊断的候选标志物。然而，本研究检测的例数偏少，纳入指标尚不能涵盖全部的肝癌患者检测指标，今后需进一步扩大样本量，并增加检测指标的种类，更深入地研究miR-125b潜在调控靶基因，以期有助于探索HCC发展的调控机制。