青海地区结核病易感性与NRAMP1基因多态性的相关性※

曹雪平，王兆芬&，王玉清，李 斌，李咏雪，王 玲，韩晓茹

(1.青海大学医学院，青海 西宁 810001；2.青海省第四人民医院，青海 西宁 810001)

全球大约有1/3的人口感染了结核分枝杆菌，仅有%～10%的人发病，显示感染具有明显的个体差异性，即遗传因素在结核发病过程中可能起着重要作用[1，2]。研究发现，鼠类Nramp1基因对鼠类结核病的易感有一定作用，而鼠Nramp1基因与人的NRAMP1基因有88%的同源性，因此，有研究推测它们可能有相同的功能[3]。为了探究NRAMP1基因多态性与青海地区人群结核病易感的相关性，本研究选取3′UTR、D543N、INT4三个位点研究NRAMP1基因对结核病的影响，为青海地区人群结核病的防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象

本研究选取青海省第四人民医院273例肺结核患者、289例非结核患者作为结核组、对照组，两组间研究对象一般情况均无统计学差异(P>0.05)，结果具有可比性。见表1。

表1 研究对象一般情况[n(%)]Table 1 General information of research objects[n(%)]

续表

经卡方检验显示，NRAMPI 基因3′UTR、D543N和INT4位点基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡规律，各基因型在结核组和对照组中的分布是均匀的，所选择的人群具有群体代表性。

研究方案经青海大学医学院伦理委员会批准。

1.1.2 仪器与试剂

仪器：凝胶成像分析仪、Mini PCR扩增仪为美国BIO-RAD公司产品；凝胶成像分析仪、NanoDrop2000超微量分光光度计为美国Thermo Fisher公司产品；电泳仪(DYY-12)为北京市六一仪器厂产品。

试剂：DNA提取试剂盒、Taq PCR MasterMix(2×，批号：KT211)、GeneGreen核酸染料(批号：RT210)和双蒸水(ddH2O，批号：R7015)为天根生化科技(北京)有限公司产品；FokⅠ内切酶、AvaⅡ内切酶、ApaⅠ内切酶为NEB公司产品；琼脂糖(西班牙原装，批号：192255)为上海贝晶生物技术有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 研究设计方案

采用病例-对照研究，收集世居青海地区的273例肺结核患者为结核组，另选同期289名与结核组相匹配的非结核患者为对照组。采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增3′UTR、D543N、INT4位点基因并测定基因型，分析青海地区结核病易感性与NRAMP1基因多态性的相关性。

1.2.2 试验方案

1.2.2.1 血样采集

采集外周静脉血约2 mL，用2% EDTA抗凝，于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2.2 DNA提取

采用DNA提取试剂盒抽提300 μL全血中的基因组DNA进行浓度及纯度检测。

1.2.2.3 引物设计

利用NCBI的primer blast引物设计功能设计引物，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

3′UTR及D543N的引物序列：上游引物为5′-GCATCTCCCCAATTCATGGT-3′，下游引物为5′-AACTGTCCCACTCTATCCTG-3′，扩增产物长度为244 bp。

INT4的引物序列：上游引物为5′-CTGCCTCCTCACAGCTTCTCT-3′，下游引物为5′-CTGCCTCCTCACAGCTTCTCT-3′，扩增产物长度为400 bp。

1.2.2.4 目的基因扩增

采用PCR技术扩增目的基因：NRAMP1基因的PCR反应体系总体积为30 μL，包括2×Taq PCR MasterMix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA 模板1 μL，无菌双蒸水18 μL。3′UTR及D543N序列反应条件：94 ℃预变性600 s；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃延伸300 s。INT4序列反应条件为：95 ℃预变性600 s；95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35个循环；72 ℃延伸 300 s。扩增产物经电泳(用 1.8% 的琼脂糖凝胶)检测，通过凝胶成像分析仪观察扩增结果。

1.2.2.5 基因测序

PCR产物由生工生物工程上海(股份)有限公司纯化并测序，通过Chromas软件对测序结果进行比对分析。

1.2.2.6 酶切

使用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术进行酶切。对测序不合格的样本重新进行PCR扩增并进行酶切。反应总体积均为20 μL，按3′UTR、D543N、INT4顺序进行酶切：扩增产物为6、6、7 μL；10×M Buffer、0.1%BSA 各2 μL、10×AvaⅡ Buffer 2 μL、10×L Buffer各2 μL；FokⅠ1 μL、AvaⅡ1 μL、ApaⅡ各1 μL；无菌双蒸水为9、11、10 μL。反应条件：37 ℃ 1 h、30 ℃ 1 h、37 ℃ 1 h。酶切产物经电泳(用 1.8% 的琼脂糖凝胶)检测，图像经凝胶成像分析仪观察并记录。

1.2.2.7 统计学处理

采用SPSS20.0软件进行统计学分析，计数资料采用%表示，两组间比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 NRAMP1基因各位点扩增产物检测结果

对样本DNA进行扩增，通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测，以Marker标准核对PCR产物长度是否符合测序条件。以下为产物电泳图。

图1 3′UTR、D543N位点PCR产物电泳图Figure 1 Electrophoretogram of 3′UTR and D543N PCR products

图2 INT4位点PCR产物电泳图Figure 2 Electrophoretogram of INT4 PCR products

2.2 NRAMP1基因各位点序列测序结果

对各样本PCR扩增产物进行测序分析，统计其基因型。以下为测序峰图。

2.3 NRAMP1各位点基因型和等位基因频率在结核组与对照组的分布

结果显示3′UTR位点各基因型频率组间差异有统计学意义(P=0.004)，结核组中TGTG等位基因频率明显降低(P=0.001)；D543N位点各基因型频率组间差异有统计学意义(P=0.02)，结核组中G等位基因频率明显降低(P=0.024)；INT4位点基因型及基因频率在两组间均无明显差异(P>0.05)。见表2。

表2 基因型和等位基因频率的分布[n(%)]Table 2 Distribution of genotype and allele frequency[n(%)]

2.4 NRAMP1基因多态性与肺结核的关系

结果显示3′UTR位点TGTG/TGTG和TGTG/del+del/del基因型频率组间差异有统计学意义(P=0.001)，OR为2.139(1.354～3.440)；D543N位点GG和GA+AA基因型频率组间差异有统计学意义(P=0.02)，OR为1.939(1.108～3.345)；INT4基因型及等位基因频率均无组间差异(P>0.05)。见表3。

表3 基因型及等位基因频率与肺结核的关系[n(%)]Table 3 Relationship between genotype and allele frequency with tuberculosis[n(%)]

2.5 不同遗传模型下NRAMP1基因多态性与结核病易感性的关系

结果显示在不同遗传模型下，INT4位点与肺结核无关。3′UTR与显性和超显性患者的结核病发生有关[P=0.001，OR为2.139(1.354～3.440)；P=0.002，OR为0.455(0.268～0.755)]。D543N与显性和超显性患者的结核病发生有关[P=0.020，OR为1.939(1.108～3.345)；P=0.002，OR为0.515(0.299～0.902)]。见表4。

表4 NRAMP1基因模型与肺结核的关系[n(%)]Table 4 Relationship between NRAMP1 gene model and tuberculosis[n(%)]

3 讨论

结核病发生是环境因素和遗传因素共同作用的结果，在影响宿主防御机制的遗传学因素中，NRAMP1基因占有重要地位[4]。NRAMP1基因的编码产物是分子量约为60kD的疏水蛋白，位于静止期巨噬细胞晚期胞腔内，在巨噬细胞吞噬病原体后转移到吞噬体膜，这表明NRAMP1产物可能通过改变吞噬溶酶体内环境限制胞内病原体的繁殖[5-7]。

本研究发现3′UTR在结核组中的TGTG/TGTG基因型频率明显低于对照组，TGTG/del+del/del基因型携带者患结核病的风险为野生纯合型TGTG/TGTG人群的2.139倍。D543N在结核组中GG基因型频率更低，GA基因型携带者结核病的患病风险为野生纯合型GG的1.94倍。青海地区3′UTR及D543N位点多态性与结核病的关系与国内外许多研究一致。段鸿飞[8]等研究发现人群3′UTR 缺失型等位基因频率明显高于白种人；Ben[9]等研究发现3′UTR del/del位点可增大患结核病的风险，且D543N AA、AG基因型与结核病易感性有关；Liu[10]等通过meta分析发现3′UTR基因多态性与亚洲人群中结核病风险增加有关；Medapati[11]等通过病例对照研究发现3′UTR基因多态性与非洲结核病易感性相关；Fernández[12]等研究发现3′UTR基因多态性与委内瑞拉结核病易感性有关。

TGTG/TGTG基因型 TGTG/del基因型 del/del基因型图3 3′UTR位点测序峰图Figure 3 Sequencing peak of 3′UTR

GG基因型 GA基因型图4 D543N位点测序峰图Figure 4 Sequencing peak of D543N

GG基因型 GC基因型 CC基因型图5 INT4位点测序峰图Figure 5 Sequencing peak of INT4

本研究还发现INT4多态性与青海地区人群的结核病易感性无关。关于该位点基因多态性与结核病易感性的关系，已有许多国内外学者做了研究，结果不尽一致。Yuan[13]等发现INT4 C/G基因多态性与结核病高度相关；而Li[14]等研究发现在西方国家中INT4多态性与结核病易感性无关；Wu[15]等研究发现结核病易感性与3′UTR基因多态性相关，而与D543N、INT4无关。

综上所述，本研究通过对青海地区结核病易感性与NRAMP1基因多态性的相关性分析发现：(1)NRAMP1基因3′UTR、D543N位点多态性可能与青海地区人群肺结核有关；(2)NRAMP1基因3′UTR del及D543N A等位基因可能与青海地区结核病易感性有关；(3)INT4位点多态性与青海地区人群结核病的易感性无关。结果提示青海地区结核病易感性与NRAMP1基因多态性相关。