岩藻多糖调节JAK2/STAT3信号通路保护神经元免受缺氧缺糖/再灌注损伤※

巨 虎，刘川川，王 虎，樊海宁&

(1.青海大学附属医院神经外科，西宁 810001；2.青海省包虫病重点实验室，西宁 810001；3.青海大学附属医院肝胆胰外科，西宁 810001；4.青海省卫生健康委员会，西宁 810001)

最新研究显示，岩藻多糖(Fucoidan，Fu)的使用有效降低了神经功能缺损评分，减小了脑梗死缺血灶区域[1]，但其作用机制不明，本研究拟用缺氧缺糖/再灌注(Oxygen and glucose deprivation/reperfusion，OGD/RP)模型开展相关研究。

1 材料与方法

1.1 主要试剂仪器

大鼠PC12细胞、DMEM培养基、青霉素-链霉素混合液、0.25%胰蛋白酶溶液购于武汉Procell公司；胎牛血清、马血清购于美国Gibco公司；岩藻多糖购于美国Sigma公司；线粒体膜电位检测试剂盒RIPA、蛋白裂解液、ECL发光液、蛋白定量试剂盒购于美国ThermoFisher公司；Annexin V FITC/PI染色试剂盒购于美国BD Biosciences公司；Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、LC3 I/II、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3和β-actin抗体购于武汉Abclonal公司；JAK2抑制剂WP1066购于Selleck公司。NanoDrop 2000紫外分光光度计、CO2细胞培养箱购于美国ThermoFisher公司；全自动酶标仪购于瑞士Tecan公司；三气培养箱购于德国BINDER公司；蛋白电泳仪购于美国Bio-Rad公司；流式细胞仪购于美国艾森公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养方法

大鼠PC12细胞用含有10%胎牛血清、5%马血清和1%青霉素-链霉素溶液的高糖DMEM培养基置培养箱(37℃，5%CO2)，每两天以2/3的比例更换培养基。

1.2.2 OGD/RP和药物处理方法

用1 μM的FU处理细胞24 h，再加入Earle′s平衡盐溶液(EBSS)来制备OGD/RP模型。然后，将细胞转移到含有5%CO2、95%N2的厌氧箱中，在37 ℃下放置4 h行缺氧处理，之后再放入含氧正常的培养箱中培养24 h。对照组的细胞没有经过OGD/RP和FU处理，而是在正常的DMEM培养基中培养(37℃，常氧条件下培养24h)。当加入JAK/STAT抑制剂WP1066干预时，PC12细胞用10 μM WP1066预孵育30 min，经OGD/RP处理前用1 μM FU处理24 h。

1.2.3 细胞活力检测方法

使用CCK-8试剂盒检测细胞活力。将对数生长期的PC12细胞按照1×104个/孔接种到96孔细胞培养板，每组设置6个复孔，经过不同条件的处理后，加入10 μL CCK-8试剂，根据试剂盒说明书所示方法检测PC12细胞的活力。在450 nm处检测各组吸光度值。

1.2.4 细胞凋亡检测方法

使用Annexin V FITC/PI染色试剂盒按照说明书所示方法检测PC12细胞凋亡情况。将对数生长期的PC12细胞按照1×104个/孔接种到96孔细胞培养板，每组设置3个复孔。经过不同条件的处理后，将细胞密度调整为1×105个/管。细胞用Binding Buffer洗涤后，加100 μL Binding Buffer重悬细胞，并加入5 μL Annexin V FITC、5 μL PI，在室温下避光染色15 min。细胞用Binding Buffer洗涤后，加200 μL Binding Buffer重悬细胞，用流式细胞仪检测。

1.2.5 抗氧化剂酶含量检测方法

收集经处理后的PC12细胞上清液，用超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)酶联免疫吸附试验试剂盒按照说明书所示方法检测细胞培养上清液SOD、GSH-Px含量。绘制标准曲线计算SOD、GSH-Px浓度。

1.2.6 实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)方法

使用Trizol试剂提取各组细胞总RNA。使用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，以1%琼脂糖凝胶电泳法检测RNA完整性。在每组细胞的总RNA中各取2 μg RNA，按照cDNA第一链合成试剂盒说明书所示方法将总RNA反转录为cDNA。qPCR特异性引物由上海生工生物公司合成，序列：HO-1 F，5′-TGC TCA ACA TCC AGC T-3′，R：5′-GCA GAA TCT TGC ACT T-3′；GCLC F，5′-CTC CTC ACA GTC ACG GCA TT-3′，R：5′-TGA ATG GAG ACG GGT TG-3′；GCLM F：5′-AAG CCA GAC ACT GAC ACA CC-3′，R：5′-ATC TGG AGG CAT CAC ACA GC-3′；β-actin F：5′-CAT GTA CGT TGC TAT CCA GGC-3′，R：5′-CTC CTT AAT GTC ACG CCA CGAT-3′。按照SYBR®qPCR Master Mix检测试剂盒配制反应体系，用Quant Studio 5荧光定量PCR仪进行PCR实验，反应条件：95 ℃，15 min；95 ℃，10 s；60 ℃，30 s；共计40个循环。以β-actin为内参基因，用2-ΔΔCt法计算各基因相对表达量。实验重复三次。

1.2.7 蛋白印迹分析方法

收集各组细胞，用含有PMSF的RIPA裂解液于冰上裂解各组细胞30 min，离心(4℃，12000r/min，10min)后取上清液。用BCA蛋白定量法检测样品总蛋白浓度。煮沸后，将蛋白样品按照30 μg/孔在SDS-PAGE凝胶上进行电泳。电泳结束后将凝胶上的目的蛋白电转(160mA恒流)至PVDF膜，用5%脱脂奶粉在室温下封闭1 h。将膜置一抗Bax、Bcl-2、cleaved-caspase3、LC3 I/II、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、β-actin孵育(4℃，过夜)。膜经TBST缓冲液洗涤后，加入HRP标记的羊抗兔IgG孵育(室温，1h)。膜经TBST缓冲液洗涤后，用ECL超敏发光液在凝胶光成像仪下检测特异性免疫反应蛋白条带，用Image J软件分析条带灰度值。

1.2.8 活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平检测方法

使用2′，7′-二氯荧光素-二乙酸酯(DCFH-DA)染色液染色后分析PC12细胞中的ROS水平。收集各组PC12细胞沉淀，用PBS清洗三次后，将细胞转移到24孔细胞培养板(1.0×104个/孔)，加入10 μM DCFH-DA孵育(避光，30min)后用流式细胞仪分析。

1.2.9 线粒体膜电位(MMP)检测方法

使用荧光探针JC-1检测PC12细胞的线粒体膜电位水平。将PC12细胞加入10 μM JC-1孵育(37℃，30min)，将孵育细胞用PBS洗涤一次后加PBS重悬细胞，用流式细胞仪分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 FU抑制PC12细胞免受OGD/RP诱导的增殖抑制和避免细胞凋亡

首先，我们确定了FU对PC12细胞活力和细胞凋亡存在影响。CCK-8检测显示，与Control组细胞相比，OGD/RP诱导的细胞活力下降；而经FU处理后，这种情况得到了明显缓解。(表1)与Control组细胞相比，经OGD/RP诱导的细胞凋亡有所增加，而经FU处理后相较于OGD/RP组细胞凋亡率减少。(图1，表2)用蛋白印迹法分析细胞凋亡调节因子(Bax、Bcl-2和cleaved-caspase3)发现，与OGD/RP诱导的细胞相比，经FU处理24 h后Bax、cleaved-caspase3细胞凋亡蛋白表达量明显减少，Bcl-2蛋白表达量增加。(图2，表3)

表1 FU处理对PC12细胞增殖的影响值Table 1 Effects of FU treatment on the proliferation of PC12

图1 经FU处理后的PC12细胞凋亡图Figure 1 PC12 cells apoptosis after FU treatment

表2 经FU处理后的PC12细胞凋亡率分析结果Table 2 Analysis of PC12 cells apoptosis rate after FU

图2 FU对PC12细胞凋亡相关蛋白表达的影响图Figure 2 Effects of FU on the expression of apoptosis-related proteins in PC12 cells

表3 FU对PC12细胞凋亡相关蛋白表达的影响值Table 3 Effects of FU on the expression of apoptosis-related proteins in PC12

2.2 FU减少了由OGD/RP诱导的PC12细胞氧化应激和自噬的发生

脑损伤过程中细胞凋亡的发生伴随有细胞自噬的改变，我们进一步检测了FU是否能抑制OGD/RP诱导的细胞发生氧化应激和自噬。用1 μM FU处理PC12细胞24 h后再经OGD/RP处理，经DCFH-DA染色后用流式细胞仪分析所得结果显示，与对照组细胞相比，OGD/RP能明显提高细胞内ROS水平(P<0.05)。(图3，表4)另外，与OGD/RP诱导的细胞相比，FU处理降低了ROS水平(P<0.05)。(图3，表4)由于抗氧化蛋白(如SOD、GSH-Px)具有预防氧化应激的功能，我们进一步检测了各组细胞中这些蛋白的表达水平。经OGD/RP处理后，SOD、GSH-Px含量明显下降(P<0.05)。(表4)正如预期的那样，与OGD/RP诱导的细胞相比，经FU处理，SOD、GSH-Px表达水平显著增加(P<0.05)。(表4)

图3 经FU处理后的PC12细胞中的ROS分析图Figure 3 ROS analysis of PC12 cells after FU treatment

表4 经FU处理后的PC12细胞ROS和培养上清液中SOD、GSH-Px的表达水平Table 4 Expression levels of ROS in PC12 cells and SOD，GSH-Px in supernatant after FU

值得注意的是，氧化应激通常表现为细胞自噬的改变，我们进一步检测了FU处理PC12细胞后对MMP和细胞自噬的影响。结果表明，OGD/RP会导致MMP的损耗(P<0.05)，但经FU处理可使MMP损耗减少。(图4，表5)细胞自噬是一种应对损伤的病理生理反应，LC3是一个自噬蛋白的标志物。当自噬发生时，LC3 I被泛素化修饰，并与自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺结合形成LC3 Ⅱ。在本研究中，我们用Western blot法来检测LC3自噬蛋白的表达水平。OGD/RP诱导的PC12细胞的LC3的表达水平增加(图5，表5)，而经FU处理，LC3蛋白的表达水平降低。这些结果表明，经FU处理可以保护PC12细胞免受OGD/RP引起的氧化损伤和自噬。

图4 经FU处理PC12细胞线粒体膜电位图Figure 4 Mitochondrial membrane potential of PC12 cells after FU treatment

图5 FU对PC12细胞LC3 I/II蛋白表达的影响图Figure 5 Effects of FU on the expression of LC3 I/II protein in PC12 cells

表5 FU对PC12细胞MMP水平和LC3 I/II蛋白表达的影响值Table 5 Effects of FU on the level of MMP and the expression of LC3 I/II protein in PC12

2.3 FU能抑制OGD/RP诱导的PC12细胞JAK2/STAT3水平

我们进一步确认了FU处理PC12细胞是否影响JAK/STAT信号通路的改变，明确了FU对OGD/RP诱导的JAK/STAT信号通路激活的影响(图6，表6)。与Control组相比，OGD/RP能显著增强JAK2和STAT3的磷酸化水平(P<0.05)。与OGD/RP组相比，FU处理能抑制OGD/RP诱导的JAK2/STAT3的激活。这些结果表明，FU的抗OGD/RP作用可能通过抑制JAK2/STAT3的途径来实现。

图6 FU对PC12细胞JAK/STAT信号通路蛋白表达的影响图Figure 6 Effects of FU on the protein expression of JAK/STAT signal channel in PC12 cells

表6 FU对PC12细胞JAK/STAT信号通路蛋白表达的影响值Table 6 Effects of FU on the protein expression level of JAK/STAT signaling pathway channel in PC12

2.4 FU通过介导JAK2/STAT3信号通路实现对OGD/RP的抗损伤作用

为了进一步验证FU抗OGD/RP引起的凋亡和自噬作用是否与JAK/STAT信号通路相关，我们使用JAK/STAT抑制剂WP1066后进一步检测细胞凋亡和自噬相关改变情况。首先，我们检测了FU和WP1066共同作用于PC12细胞后对抗氧化剂酶含量的影响。结果表明，与经FU+OGD/RP处理的细胞相比，WP1066组的细胞培养上清液中抗氧化酶SOD、GSH-Px的含量增加，但差异无统计学意义(P>0.05)。(表7)进一步检测经WP1066和FU处理后的MMP水平，结果显示，与经FU+OGD/RP处理的细胞相比，经WP1066处理的MMP水平增加(P<0.05)(图7，表8)；而ROS水平有降低的趋势，但无统计学意义(P>0.05)(图8，表8)。

表7 经FU和WP1066共处理的PC12细胞培养上清液中SOD、GSH-Px的比较结果Table 7 Comparison of SOD and GSH-Px in PC12 cells culture supernatants co-treated with FU and

图7 经FU和WP1066共处理PC12细胞对MMP的影响图Figure 7 Effects of PC12 cells co-treated with FU and WP1066 on MMP

图8 经FU和WP1066共处理的PC12细胞对ROS的影响的流式分析图Figure 8 Flow cytometric analysis of PC12 cells co-treated with FU and WP1066 on ROS

表8 经FU和WP1066共处理的PC12细胞MMP和ROS的比较结果Table 8 Comparison of MMP and ROS in PC12 cells co-treated with FU and

最后，我们研究了WP1066抑制剂对细胞凋亡和自噬相关蛋白的影响情况。蛋白印迹分析证明，与OGD/RP+FU组相比，经WP1066处理能增强FU效果、抑制PC12细胞凋亡(P<0.05)(图9，表9)；而LC3 I/II有减少的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)(图9，表9)。这些发现进一步表明，抑制JAK2/STAT3信号通路能加强FU抗OGD/RP引起的细胞凋亡和自噬作用。

图9 经FU和WP1066共处理的PC12细胞凋亡和自噬蛋白分析图Figure 9 Apoptosis and autophagy protein analysis of PC12 cells co-treated with FU and WP1066

表9 FU和WP1066共处理对PC12细胞凋亡和自噬蛋白表达的影响值Table 9 Effects of co-treatment of FU and WP1066 on apoptosis and autophagy protein expression of PC12

3 讨论

缺血性脑卒中是最常见的中风类型。它是一种常见的临床疾病，通常会导致血管和神经元损伤。神经元损伤是脑缺血性卒中患者长期致残的主要原因。然而，目前还没有有效的方法来治疗神经损伤。因此，迫切需要筛选抗神经元损伤药物。在本研究中我们发现，岩藻多糖能逆转OGD/RP引起的细胞增殖抑制，降低细胞凋亡和自噬的发生。此外，FU能通过JAK1/STST3通路调节PC12细胞凋亡和自噬过程。

缺血性脑卒中发生时，以脑血管为主导的区域中心会形成核心区和周围的缺血半影区，核心区神经元出现坏死，缺血半影区神经元出现凋亡(是保护的关键)[2]。脑缺血后，与细胞凋亡相关的蛋白，如Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3发生变化[3]。此外，有证据表明氧化应激产生的ROS可以介导细胞凋亡[4]。之前的研究证实，经OGD/RP诱导后的ROS含量明显增加[5]，这与我们的研究一致。细胞增殖和凋亡的动态平衡对维持环境稳态具有重要作用。OGD/RP处理会抑制细胞的活力、促进PC12细胞凋亡和抑制抗氧化酶SOD、GSH-Px表达。而经FU处理可以明显抑制OGD/RP引起的细胞凋亡，并促进抗氧化酶SOD、GSH-Px的表达。这些结果表明FU能通过抑制细胞凋亡和促进抗氧化酶表达保护神经元免受OGD/RP引起的损伤。

越来越多的数据证实细胞凋亡和自噬之间存在复杂关联。自噬可以通过抑制caspase维持细胞存活[6]。自噬专门降解聚集的蛋白质和受损的细胞器，维持细胞平衡[7]。实际上，细胞在较低的基础水平时通过自噬来维持稳态。先前的研究表明，自噬在早期脑损伤时具有神经保护作用，其保护作用至少部分是通过其抗凋亡作用实现的。本研究显示，FU能拮抗OGD/RP造成细胞线粒体膜电位升高和自噬的发生，通过使用WP1066抑制剂证实FU抑制自噬的发生是通过JAK2/STAT3信号通路来实现的。有证据显示，OGD/RP可以激活自噬，被激活的自噬可能是OGD/RP导致神经元损伤的一个因素[8]。相反，也有研究显示，被激活的自噬对大鼠局灶性脑缺血有神经保护作用[9]。值得注意的是，我们的研究结果与之前的研究结果不同，之前的研究认为FU以一种不依赖caspase的方式提高自噬体的含量和细胞死亡率[10]。

大量证据证明[11，12]，FU是JAK/STAT信号通路抑制剂，可以降低各种肿瘤细胞的STAT3激活水平，最终抑制肿瘤的生长。JAK/STAT信号通路是一条重要的细胞内信号通路，参与了神经元的生长、发育、分化、衰老等过程，并与脑缺血、脑肿瘤等神经系统病理过程密切相关[13，14]。在PC12细胞中，OGD/RP损伤可上调L型Ca2+通道和促进ROS的产生，增加Ca2+的流入，从而触发了包括STAT3在内的缺氧平衡转录因子的表达[15]。在大鼠大脑中动脉闭塞模型中，脑组织的神经元和星形胶质细胞中STAT3的磷酸化明显增强[16，17]。在缺血性脑损伤中，JAK/STAT信号通路的内在机制包括调节细胞凋亡[18]、抑制神经炎症[19]和改善氧化压力[15]。目前，还没有关于JAK/STAT信号通路调节缺血性脑损伤中神经元自噬过程的研究。我们的研究结果显示，对于OGD/RP诱导的PC12细胞，FU能抑制PC12细胞的凋亡、自噬和氧化应激反应，同时FU还能调控JAK2/STAT3信号通路增强该抑制作用。

综上所述，FU使OGD/RP诱导的PC12细胞免受氧化应激、自噬和凋亡作用，FU的神经保护作用可能是通过抑制JAK/STAT信号通路实现的。