网络药理学对乳增宁胶囊治疗乳腺增生作用机制研究

张好科　付兆媛　贾永翠

关键词：网络药理学;乳增宁胶囊;乳腺增生;HE染色

中图分类号：R285 文献标志码：A

乳腺增生[1]（Hyperplasia of mammary glands，HMG）是乳腺正常发育和退化过程失常导致的一种良性乳腺疾病，病变主要发生在乳腺导管和小叶。研究发现HMG 好发于25～45岁女性，其中大城市职业妇女占据50%～70%，并且本病极容易复发，癌变率为2%～4%[2-4]。2013年贵州省[5]进行女性乳腺疾病筛查，结果发现在38256人中患有HMG的达6075人，占良性乳腺疾病86. 28%，可见HMG是现代女性较常见的多发病之一，对女性的身心健康影响较大。HMG 病因尚不清楚，但研究发现下丘脑—垂体—卵巢—乳房内分泌轴平衡失调，特别是雌激素分泌增加、孕激素分泌减少是主要病因[4，6]。目前HMG 的治疗主要以激素与手术治疗为主，但是由于激素受体在机体广泛分布的原因，使现代医学治疗手段存在较多副作用，所以促使寻找新的治疗方法势在必行。

中医认为，HMG 归属于[7-8]“乳中结核”、“乳核”、“乳内硬肿”、“乳癖”等范畴，发病与肝、脾、肾的关系最为密切。中医以整体观念和辨证论治为指导思想，通过对机体的整体调节而发挥作用，从而发挥临床疗效。乳增宁胶囊由艾叶、淫羊藿、天冬、柴胡、川楝子、土贝母6 味中药组成，主要功能疏肝理气，活血化瘀，调理冲任。药理研究发现[9]乳增宁胶囊的主要成分有淫羊藿苷、土贝母苷甲、土贝母苷乙、土贝母苷丙、棕矢车菊素、异泽兰黄素、柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 等。研究发现[10]淫羊藿苷具有雌激素活性;土贝母苷甲具有显著的抗肿瘤作用;柴胡皂苷- d[11]有可能抑制乳腺癌细胞增殖和转移。临床研究发现乳增宁胶囊对MHG具有显著疗效，并且不良反应少。然而乳增宁胶囊因其复杂化学系统和生物系统之间相互作用使其临床应用受到限制。网络药理学方法[12]是揭示中药复方多成分、多途径、多靶点疗效模式的重要方法，其与中医的辨证论治思想不谋而合，为探索中药复方的靶标提供了可能。因此本研究采用网络药理学探讨乳增宁胶囊对HMG 的作用机制并结合动物实验对其疗效进行验证。

1资料与方法

1.1网络药理学

1.1.1乳增宁胶囊药物活性成分及靶点的筛选

在中药系统药理学数据库及分析平臺（Tradition⁃al Chinese Medicine Systems Pharmacology Database andAnalysis Plat- form，TCMSP）中逐此次输入关键字艾叶、淫羊藿、天冬、柴胡、川楝子、土贝母检索6 味中药的活性成分，并以口服生物利用度（OB≥30%）与类药性DL≥0.18 为筛查条件。采用筛选药物活性成分的分子编码，进行检索药物活性成分相关靶标。

1.1.2 HMG 疾病靶点的筛选

采用GeneCard数据库检索框输入关键词hyper⁃plasia of mammary glands 检索HMG 相关靶点。

1.1.3药物活性成分与疾病共同靶点的筛选及蛋白互作网络构建

运用Perl语言筛选药物活性成分与HMG 疾病的共同靶点，并绘制韦恩图;在线采用STRING与Cyto⁃scape 3.7.2软件制作共同靶点蛋白互作网络（PPI），最低相互作用阈值设为“highest confidence”（>0. 7），“节点（node）”代表不同靶点，“边（edge）”代表不同靶点之间的相互关系网络。

1.1.4药物活性成分与疾病靶点互作网络构建

采用Cytoscape 3.7.2 软件构建药物活性成分与疾病靶点互作网络，“节点（node）”代表不同疾病靶点、药物活性成分，“边（edge）”代表疾病靶点与药物活性成分之间的相互作用关系。

1.1.5 GO分析与KEGG富集分析

采用R编程语言对药物活性成分与疾病共同靶点进行GO分析与KEGG富集分析，并采用Cytoscape 3.7.2软件对靶点集进行相关性计算，构建富集通路与靶点互作网络，确定核心靶点，对核心靶点进行实验验证。

1.2动物实验

1.2.1药物及试剂准备

乳增宁胶囊（陕西健民制药有限公司，规格：0.5mg×36粒，批准文号：国药准字Z20044180，）购自生产批号Z10950011;他莫昔芬（扬子江药业集团有限公司，规格：10mg×60片，批准文号：国药准字H32021472）;雌性Wistar 大鼠（200±5g）（许可编号：SCXK-（A）2012-0004）购自甘肃中医药大学实验动物中心。

1.2.2造模与分组

动物在SPF 实验室中饲养（饲养条件：12：12h，光照：黑暗;温度：25±2 °C;湿度：50±10%）。适应后7d，将24 只Wistar大鼠随机分为4 组（正常组、模型组、他莫昔芬组、乳增宁胶囊组），每组6 只。本研究采用依次腹腔注射雌激素（0.5mg /kg /d）25d，孕激素（5mg/kg /d）5d的方法建立HMG 动物模型[13]。模型组、阳性对照组、药物干预组动物均采用上述造模方法建立HMG动物模型。药物干预期间正常组和模型组接受与药物组相同体积的生理盐水灌胃;他莫昔芬组动物接受他莫昔芬4 mg / kg /d灌胃治疗;乳增宁胶囊组动物接受乳增宁胶囊0.6 g/kg/d 灌胃给药。

1.2.3病理组织切片

本研究采集所有大鼠左侧第二个乳腺通过HE染色方法评价乳腺增生的程度及乳增宁胶囊的干预效果。HE染色切片的制作主要步骤如下：用10% 的马林固定24h，转移至70% 的乙醇中并石蜡包埋处理，组织切片厚度为4μm，用苏木精/伊红进行染色。

2结果

2.1乳增宁胶囊活性成分、靶点及HMG 靶点的筛选

在TCMSP数据平台共检索到乳增宁胶囊生物活性成分81个、药物作用相关靶点共1314个，经去重之后得到76个生物活性成分、242個作用靶点;在Gene⁃Card数据平台以“score≥10为筛查条件”共检索到HMG相关人类基因665个，然后采用Perl语言筛选出乳增宁胶囊与HMG共同靶点99个，并以韦恩图的形式展示，如图1，作用于疾病靶点的药物活性成分有30个;并采用STRING+Cytoscape 3.7.2软件构建共同靶点之间互作网络关系（PPI），结果共得到99个节点、842条边，如图2。

2.2药物活性成分与疾病靶点互作网络关系构建

采用Cytoscape 3.7.2软件构建药物活性成分与疾病靶点互作网络关系图，共得到129个节点（30个药物活性成分、99个疾病靶点）、272条边，如图3。

2.3 GO生物过程与KEGG信号通路富集分析

采用R编程语言对乳增宁胶囊有效成分与HMG的共同靶点进行GO与KEGG富集分析，得出GO富集分析前20 个相关靶点的生物学过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）富集，结果以气泡图形式呈现，如图4、5、6。排名前5 的生物学过程分别是对金属离子的反应（response to metal ion）、对类固醇激素的反应（response to steroid hormone）、对氧化应激的反应（re⁃sponse to oxidative stress）、对细胞氧化应激的反应（cel⁃lular response to oxidative stress）、对辐射的反应（re⁃sponse to radiation）。KEGG 富集分析得到前20个富集通路，主要有PI3K-Akt 信号通路（PI3K−Akt signalingpathway，PI3K/AKT）、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染（Kaposi sarcoma- associated herpesvirus infection，KSHV）、乙型肝炎（Hepatitis B，HB）、人巨细胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection，HCMV）、癌症中的蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）等，结果以气泡图形式呈现，如图7;并将富集通路与蛋白结果导入Cyto⁃scape 3.7.2软件绘制富集通路与蛋白关系网络，结果发现主要核心蛋白有丝裂原激活的蛋白激酶1（MAPK1），PKB蛋白激酶1（AKT1）和细胞周期蛋白（CCND1）等，如图8。

2.4HE染色

HE染色镜下见，空白组大鼠乳腺导管走形规则，管壁光滑，管腔内未见异常分泌物堵塞，导管上皮细胞排列均匀、无水肿，乳腺小叶分裂较少，腺泡数目少且体积较小;模型组大鼠乳腺导管明显增多并扩张，管壁粗糙、增生，管腔内可见异常分泌物增多，导管上皮细胞排列紊乱、水肿明显、呈多层分布，腺泡体积增大、数目增多，乳腺小叶分裂明显，呈现出典型的乳腺增生病理改变;阳性对照组乳腺导管走形基本规则，管壁较为光滑，管腔内可见少许异常分泌物堆积，导管上皮细胞排列较均匀、无水肿，基本呈现单层分布，乳腺小叶分裂不明显，腺泡数目及体积与正常组相当;乳增宁胶囊组腺泡上皮呈分泌状，被覆单层立方或扁平上皮，排列略紊乱，导管轻度扩张，管壁较为光滑，腔内少许分泌物，腺泡体积与模型组相比明显缩小、数目与正常组相当，如图9。

3讨论

近年HMG[14]发生率越开越高，现代医学认为本病发病与内分泌的失调，特别是与雌孕激素比例失调相关，但是总体而言，HMG发病机制尚不清楚，故对乳腺增生的治疗也是一个棘手问题。中医学认为乳腺增生的主要病因病机在肝郁脾虚与冲任不调两方面。肝主疏泄，性喜调达而恶抑郁，情志不遂，忧郁愤怒，则肝气郁结，气机阻滞，气滞则血瘀;脾主运化，脾气健则运化强，脾失健运则水湿失运，痰浊内生，血瘀与痰浊凝结于乳房而发;肾主生长发育、冲脉为气血之海、任主胞胎，生育、流产等伤及冲任，则肝血不足，气血凝滞，日久而发[15-18]。临床研究[19-21]发现乳增宁胶囊对乳腺增生具有显著的改善作用。本研究采用网络药理学方法在乳增宁胶囊与HMG的“药物有效成分-疾病靶点网络关系”发现二者具有潜在的相关性，主要活性成分有β-谷固醇、豆甾醇、槲皮素、山萘酚、乙酸亚油酯等。通过GO分析发现乳增宁胶囊通过调控乳腺增生对金属离子、类固醇激素、氧化应激、细胞氧化应激、辐射的反应等生物学过程，发挥抗乳腺增生的效应，同时在氧化应激反应的生物学过程中参与的多大30 个，可见氧化应激在HMG的发生发展过程中具有重大作用。

通过KEGG富集分析发现乳增宁胶囊抗乳腺增生作用的通路主要包括PI3K/AKT、KSHV、HB、HCMV、癌症中的蛋白多糖等信号通路，并且在PI3K/AKT信号通路富集的蛋白多达30个。研究发现[22] PI3K/AKT信号通路可被多种有丝分裂刺激信号活化，最终在癌变过程中扮演重要角色;HCMV 参与细胞周期的调节，能引起DNA 突变、抑制免疫应答和肿瘤抑制性蛋白的功能，并且许多证据表明HCMV与乳腺癌的发生和发展有潜在联系;本研究通过KEGG 富集分析结果通路与蛋白互作关系发现主要核心蛋白包括MAPK1、AKT1、CCND1 等[23-24]。MAPK1在乳腺癌患者中呈现高表达，通过下调MAPK1 的表达可调控人乳腺癌MCF-7 细胞增殖和凋亡;AKT1对乳腺癌细胞迁移具有负性调控的作用[25-26];CCND1在良性乳腺疾病及乳腺癌中呈现高表达，在乳腺癌的发生发展中具有重要的作用[27]。通过HE染色方法对乳腺组织增生情况进行评价，发现乳增宁胶囊组动物乳腺组织增生明显抑制，提示乳增宁胶囊治疗乳腺增生有明显作用。

乳增宁胶囊可能通过调控氧化应激、炎症反应、细胞凋亡等途径从而明显抑制乳腺组织增生，本研究为揭示乳增宁胶囊临床治疗HMG的分子机制提供了重要参考依据。