石粉对全混合日粮发酵品质和微生物种群的影响

■李荣荣 郑猛虎 王 妍 崔欣雨 曹晓慧 姜 鑫 徐春城

（中国农业大学工学院，北京 100083）

发酵全混合日粮（TMR silage）是根据家畜不同生产阶段的营养需要和饲料原料的营养价值，设计科学合理的日粮配方，采用高密度成型、拉伸膜裹包技术，经过乳酸菌发酵而调制成的一种营养平衡的日粮[1]。大量研究证明，不宜存放的高水分工业和农业副产品可用于调制发酵TMR并取得良好的发酵品质[2-5]。高水分的食品加工副产品可以替代一部分精料，既不影响其适口性和营养价值，还可以降低成本，节约饲喂前进行混合的时间，减少渗出液的损失。而且，TMR经过厌氧发酵后有氧稳定性明显增强[6-7]。此外，高密度成型便于发酵TMR的商品化流通。然而，在发酵TMR技术的推广过程中，一些生产厂家在生产发酵TMR时，由于发酵时间长、环境温度高（特别是夏季）、水分含量高等原因，往往造成发酵TMR的过度发酵，酸度大（pH低于3.8），引起奶牛（特别是高产奶牛）采食速度下降、干物质采食量降低，进而影响到奶牛的生产性能[8]。因此，研究开发一种既不影响发酵TMR的发酵质量，又能够有效缓解pH过低的发酵调控方法，对于进一步推进发酵TMR技术的应用具有重要的现实意义。

石粉是动物饲料中最常见的矿物质原料，它能够提高饲料中钙的含量，其主要成分是碳酸钙。研究表明：添加1.0%和1.5%石粉能够提高甘蔗青贮的体外干物质、有机物以及纤维的消化率，提高饲料的营养价值[9]。Niu 等[10]指出添加1.5%石粉能够提高无芒雀麦青贮的pH和乳酸含量，改善青贮发酵品质，并抑制好氧变质过程中好氧细菌和酵母菌的生长，提高开封后的有氧稳定性。Tian 等[11]指出随着石粉添加比例的增大，发酵TMR的有氧稳定性显著提高，而氨态氮（NH3-N）含量显著增加，在一定程度上降低TMR的发酵品质。本试验通过分析在高温贮藏条件下，添加不同比例的石粉对以鲜啤酒糟为主要原料调制的TMR发酵品质、化学组分及微生物种群的影响，探究缓解发酵TMR 在高温条件下过度发酵的方法，为发酵TMR技术的推广提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鲜啤酒糟取自北京市某啤酒厂；石粉（饲料级）主要成分是碳酸钙，含钙量在38%以上，镁含量在0.5%以下，购自佳慧牧歌。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

试验采用随机区组设计，共设4个组：0.5%、1.0%和1.5%石粉的试验组（以鲜重计）以及不添加石粉的对照组，依次编号为L1、L2 组和L3 组以及L0 组。分别在厌氧发酵7、21、35、56 d和90 d后开封，进行发酵品质、化学成分和微生物种群的动态测定，每个处理重复3次。

1.2.2 发酵TMR调制（见表1）

表1 发酵全混合日粮组成

按照表1 的配方，将TMR 原料混合均匀后，分别取约1 000 g样品装入专用青贮袋中，迅速抽真空密封（RS-320型真空包装机），贮藏在35 ℃恒温培养箱中。

1.2.3 测定项目和分析方法

每袋样品开封后充分混匀并分成两个子样品。准确称取第1 份样品20 g 装入灭菌自封袋中，加入180 mL 灭菌去离子水，用无菌均质器处理30 s，制得浸提液。将浸提液分成两部分，一部分进行微生物的稀释平板菌落计数和pH 测定（Mettler To-ledo-S20,Switzerland）。另一部分通过4层纱布及定性滤纸过滤后置于-20 ℃冰箱中冷冻存放，用于有机酸和NH3-N含量的测定。准确称取第2 份样品约150 g（精确到0.01 g），置于65 ℃鼓风干燥箱中干燥48 h，测定干物质（DM）含量，并粉碎过1 mm筛备用。总氮（TN）含量采用凯氏定氮法（KDY-9830 型凯氏定氮仪）测定；粗蛋白（CP）含量则由总氮（TN）乘以6.25得到；可溶性碳水化合物（water soluble carbohydrate，WSC）含量采用蒽酮-硫酸比色法测定[12]；酸性洗涤纤维（acid ditergent fi⁃ber，ADF）含量和中性洗涤纤维（neutral detergent fi⁃bre，NDF）含量采用范氏纤维洗涤法[13]测定；NH3-N 含量采用苯酚-次氯酸钠比色法测定[14]；有机酸含量采用HPLC法（日本岛津LC-20A型，色谱柱：Shodex KC-811，流动相：3 mmol/L高氯酸溶液，流速：1 mL/min，进样量：5 μL，柱温：50 ℃，检测波长：210 nm）测定。乳酸菌（LAB）采用MRS培养基（Difco，美国）置于37 ℃恒温厌氧培养箱中培养48 h后计数。好氧细菌和酵母菌分别采用营养琼脂（NA）培养基（Nissui，日本）和马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（Nissui，日本）置于30 ℃恒温培养箱中培养48 h后计数。

1.3 数据处理和分析

采用SPSS 21.0 软件对所测数据进行统计分析，分别对处理、发酵时间及二者的交互作用进行双因素方差分析，并用Tukey 方法对处理间平均值进行多重比较（P<0.05）。

2 试验结果与分析

2.1 TMR原料的化学组分和微生物数量（见表2）

表2 TMR原料的化学组成和微生物数量

如表2所示，DM含量和WSC含量分别为45.60%FM和8.43% DM。乳酸菌、酵母菌和好氧细菌的数量分别为6.51、4.06 lg CFU/g FM和7.42 lg CFU/g FM。

2.2 添加石粉对TMR发酵品质的影响（见表3）

如表3所示，处理和发酵时间显著影响发酵TMR的pH、乳酸、乙酸、丙酸含量和NH3-N含量（P<0.05）。在整个发酵过程中，随着石粉添加比例的增加，发酵TMR 的pH 显著升高（P<0.05）；在发酵第90 天时，L0组的pH降至4.04。在整个发酵过程中，与L0组相比，L3 组有更高的乳酸和乙酸含量（P<0.05）。所有处理组在整个发酵过程中始终未检测到丁酸。与L0组和L1 组相比，L3 组在整个发酵过程中有更高的NH3-N含量（P<0.05）；随着发酵时间的延长，L1、L2 组和L3组的NH3-N含量显著升高（P<0.05）。发酵第90天时，L0、L1组和L2组的NH3-N含量在5% TN以下。

表3 添加石粉对TMR发酵品质的影响

2.3 添加石粉对发酵TMR化学组分的影响（见表4）

表4 添加石粉对发酵TMR化学组分的影响

如表4 所示，处理、发酵时间及二者的交互作用显著影响TMR 青贮的DM 和WSC 含量（P<0.05）。与L0组相比，L3组在发酵第56天和第90天时有更低的DM含量和WSC含量（P<0.05）；与发酵第7天相比，所有试验组在发酵第90 天时有更低的DM 含量和WSC含量（P<0.05）。与L0 组相比，L2 组和L3 组在发酵第90天时有更低的NDF含量和ADF含量（P<0.05）。

2.4 添加石粉对发酵TMR微生物组成的影响（见表5）

表5 添加石粉对发酵TMR微生物组成的影响(lg CFU/g FM)

如表5 所示，处理、发酵时间及二者的交互作用显著影响乳酸菌和好氧细菌数量（P<0.05）。与L0 组和L1 组相比，L3 组在整个发酵过程中有更高的乳酸菌和好氧细菌数量（P<0.05）。与L0 组相比，L3 组在发酵前21 d过程中有更低的酵母菌数量（P<0.05），然而在发酵第35-90 d 过程中，所有试验组的酵母菌数量在检测限以下。

3 讨论

TMR原料通常具有充足的WSC含量和乳酸菌数量来保证快速的乳酸发酵，抑制有害微生物对营养成分的分解作用，从而有效保存饲料的营养价值。然而大量的有机酸积累往往导致青贮饲料过低的pH[6-7]，尤其是在夏季高温、低DM 含量和延长发酵时间的条件下，影响发酵TMR的适口性，降低饲料采食量。为了探究石粉对高温条件下以鲜啤酒糟为主要原料（约占鲜重的54.0%）调制的TMR发酵特性的影响，本研究将水分调至55.0%，在35 ℃条件下厌氧发酵90 d。结果表明，经过90 d发酵后，不添加石粉的L0组发酵品质良好，表现在高的乳酸、未检测出丁酸以及检测出含量较低的丙酸和NH3-N，这与之前的研究结果类似[2-4]。饲料适宜的酸碱度是改善日粮适口性和提高消化率的关键[15]，然而经过90 d的发酵，添加石粉的3个试验组的发酵TMR，在显著提高pH（从4.46 提高到4.76）的同时，也促进了乳酸菌的增殖和乳酸的积累，相对于L0组较低的pH（4.04），降低了发酵TMR的酸度，会在一定程度上提高其适口性。石粉中含有丰富的金属元素（如钙、镁、钾和锰等）[10]，适量的镁和锰元素的补充可以提高乳酸菌的生长速率[16-17]；此外大部分乳酸菌都属于嗜中性微生物，适宜的生长pH 范围为5.0～9.0[18]。石粉中的碳酸盐等盐类物质与发酵生成的有机酸反应，生成有机酸盐，有效地缓和了发酵TMR 的pH 下降，这些都为乳酸菌的生长创造有利条件。目前关于石粉对青贮中乳酸菌发酵类型影响的研究较少，Santos 等[19]指出石粉能够抑制甘蔗青贮中乙醇的产生，而乙醇是异型乳酸菌发酵的主要产物，因此，石粉可能对异型发酵乳酸菌有潜在的抑制作用。本研究发现添加石粉促进乙酸的积累和好氧细菌的繁殖，因此，乙酸的积累可能与好氧细菌的增加有关。乳酸菌和好氧细菌等微生物在繁殖过程中能够将TMR原料中丰富的WSC转化为乳酸和乙酸等有机酸类，大量的有机酸积累造成发酵TMR 快速的pH下降，最终能够终止发酵，而石粉的中和作用能够延缓发酵TMR 快速的pH 下降，延长发酵期，从而有利于积累更多的乳酸和乙酸等有机酸类。酵母菌耐酸性强，常规地降低pH难以抑制酵母菌的繁殖，而短链脂肪酸能够有效抑制其生长[1]。本研究中，添加石粉促进发酵TMR 中乙酸和丙酸的产生，在一定程度上抑制发酵TMR 初期酵母菌的生长。NH3-N 含量是反映氨基酸分解程度的重要指标，青贮中NH3-N的积累主要来自梭菌和肠细菌对氨基酸的分解作用，然而梭菌和肠细菌不耐酸，当pH 降至4.50 以下时可有效抑制其活动[18]；此外，梭菌对水分极为敏感，当DM含量超过30%时生长受抑制，而超过40%时可以完全抑制[1]。本研究发现L2 组和L3 组在发酵整个过程中pH 都在4.50以上，丁酸始终在检测限以下，说明较高的DM含量抑制梭菌增殖，然而NH3-N含量在整个发酵过程中显著升高，说明肠细菌可能对NH3-N的积累起主要作用。Hao 等[20]指出耐酸性的乳酸菌包括植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、粪肠球菌（Enterococcus fae⁃calis）和屎肠球菌（Enterococcus faecium）能够分泌蛋白酶，本研究发现与第7天相比，各试验组在发酵第56天时NH3-N含量显著增加，可能是部分耐酸性乳酸菌活动的结果。随着石粉比例的增加发酵TMR的酸化速率逐渐下降，导致在发酵第90 天时L3 组的NH3-N 含量达到5% TN 以上。尽管添加石粉有效缓和发酵TMR的pH快速下降，为乳酸菌的生长创造条件，但同时促进发酵TMR 中NH3-N 含量的增加，降低了氮利用效率，加剧了DM 的损失，这并不利于营养物质的保存，潜在地降低TMR的营养价值。

碱性添加剂有助于破坏植物细胞壁中的半纤维素、纤维素和木质素的镶嵌结构，打破木质素和半纤维素之间的酯键以及纤维素和半纤维素之间的氢键，有利于细胞壁组分的分解。本研究发现，添加石粉降低发酵TMR 的NDF 含量和ADF 含量，这与之前的研究结果一致[11,21]。综上所述，添加石粉能够有效缓和发酵TMR 的酸度下降，同时促进乙酸、丙酸含量和NH3-N含量的增加。发酵第90天时，与L0组相比，L3组有更低的NDF含量和ADF含量（P<0.05），而NH3-N含量达到5% TN 以上，与L1 组相比，L2 组在乳酸、乙酸、NDF 含量和ADF 含量上无显著性差异。因此，生产上推荐添加石粉的量以不超过1.0%为宜。

4 结论

添加石粉能够提高发酵TMR的pH、乳酸、乙酸含量和NH3-N含量，降低DM、NDF、ADF含量和WSC含量，而对CP含量无显著影响。发酵第90天时，L0、L1组和L2 组的NH3-N 含量在5% TN 以下，与L0 组相比，L1 组和L2 组在发酵第90 天时有更高的pH、乳酸含量和乳酸菌数量，而L1 组和L2 组的DM、CP、NDF含量和WSC 含量并无显著差异。因此，生产上推荐添加石粉的量以不超过1.0%为宜。