新型植物提取物添加剂对大口黑鲈生长、抗氧化及糖代谢影响的研究

■张小雨 高 彬 徐田田 韩敏祯 李松林，4 吕利群，4 许 丹，4* 刘兴旺

（1.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；2.上海海洋大学国家水生动物病原体采集中心，上海 201306；3.上海海洋大学水产养殖部淡水水生遗传资源重点实验室，上海 201306；4.上海海洋大学水产科学实验教学示范中心，上海 201306；5.上海牧渔科技有限公司，上海 201306）

大口黑鲈（Micropterus salmoides），属鲈形目、太阳鱼科、黑鲈属，因其肉质肥美、适应能力强、生长速度快等特点成为我国重要的淡水养殖品种[1]。作为一种典型的肉食性鱼类，该鱼配合饲料开发过程有一定难度[2]，其人工配合饲料形式一般是软颗粒饲料与膨化颗粒饲料[3]，且人工饲料配方在营养水平和饲料参数方面仍有不足[4]。研究显示，大口黑鲈对饲料碳水化合物利用能力十分低下[5-6]，饲料淀粉种类[7]、可消化淀粉水平[8]都会对大口黑鲈造成影响。最新研究表明，当饲料淀粉超过5%就会抑制大口黑鲈生长并造成氧化应激[9]，且大口黑鲈生长及饲料利用随饲料碳水化合物水平升高而呈线性下降，在摄食后易出现肝脏病变，生长缓慢和疾病频发等不良问题[10]。

大口黑鲈对碳水化合物的低利用率成为限制其配合饲料开发推广最重要原因之一。作为膨化配合饲料黏结及膨化成分，淀粉在饲料中添加使用是不可缺少的，因此碳水化合物引起大口黑鲈“肝糖应激”及对肝糖应激导致的炎症反应进行调控，从而改善大口黑鲈在摄食人工配合饲料后的健康状态已成为相关研究热点[2]。针对肉食性鱼类肝糖应激，一种以桑叶黄酮及栗木单宁为主要原料并复配若干功能性氨基酸的新型植物提取物添加剂被研究应用。在前期研究中发现新型植物提取物添加剂具有消除肝糖应激导致的鱼类炎症因子及促进生长等作用。本研究以大口黑鲈为研究对象，分别添加不同梯度新型植物提取物添加剂以评估其对大口黑鲈生长、抗氧化及糖代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 试验设计及饲料配制

以进口鱼粉、玉米蛋白粉、棉籽蛋白、豆粕等为主要蛋白源，鱼油、豆油为主要脂肪源，α-淀粉等为主要糖源，配制基础饲料。在基础饲料中分别添加0[S1组（对照组）]、1 500 mg/kg（S2组）和3 000 mg/kg（S3组）的新型植物提取物添加剂（购自广州飞禧特生物科技有限公司，主要成分：桑叶黄酮65%、单宁酸30%、功能性氨基酸5%），配制成3 组等氮等能的试验饲料（见表1）。各饲料原料经粉碎过筛后，按照配方称取并搅拌混匀，制成直径为2 mm 的颗粒饲料，风干后4 ℃冰箱保存备用。

表1 试验饲料配方及营养水平（%，干物质）

1.2 试验用鱼及养殖管理

养殖试验在盐城恒兴饲料有限公司淡水鱼养殖车间进行。挑选初始体质量（7.50±0.23）g的幼鱼225尾，随机分为3组，每组3个平行，每个平行25尾鱼，分别放入9个循环系统箱（70 cm×90 cm×80 cm）中。养殖试验持续8 周，每天投喂2 次，表观饱食投喂，每天记录各养殖桶的投喂克数。每天吸污换水（换水量不超过水体1/3）确保水质，24 h 连续充气增氧，期间水温25～30 ℃。

1.3 样品收集

养殖试验结束前禁食24 h，统计每个养殖桶的鱼尾总数和总重量。每个养殖桶随机抽取9 尾鱼，3 尾鱼装入自封袋保存放在-20 ℃冰箱，用于体成分测定；6尾鱼进行尾静脉取血，静置后离心（3 000 r/min，10 min，4 ℃）取上层血浆，加入100 μL 2%草酸钾，分装到离心管中置于-80 ℃待测。取血后，立即将鲈鱼解剖，取肝脏组织装入冻存管保存到-80 ℃冰箱中用于相关酶活性、基因表达量的测定。

1.4 指标测定及分析方法

1.4.1 生长指标的计算方法

存活率（SR，%）=（试验结束时试验鱼数目/试验开始时试验鱼数目）×100

增重率（WGR，%）=(终末体重-初始体重)/初始体重×100

特定生长率（SGR，%/d）=[ln（终末体重）-ln（初始体重）]/试验天数×100

饲料系数（FCR）=耗料量/（终末体重-初始体重）

1.4.2 饲料和鱼体组成常规营养成分测定

水分含量采用105 ℃烘箱干燥法（GB 5009.3—2016）测定；粗脂肪含量采用索氏抽提法（GB 5009.6—2016）测定；粗蛋白含量采用凯氏定氮法（GB 5009.5—2016）测定；粗灰分含量采用马弗炉灼烧法（550 ℃）（GB 5009.4—2016）测定。

1.4.3 血浆生化指标测定

取保存于-80 ℃的血浆，4 ℃冰箱解冻。检测血糖（GLU）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、总蛋白（TP）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）和白蛋白（ALB）含量，GLU含量采用葡萄糖氧化酶法测定，TC、TG、TP、LDL、HDL 和ALB 含量使用南京建成生物工程研究所有限公司试剂盒测定。

1.4.4 肝脏酶活性指标测定

取保存于-80 ℃的肝脏，4 ℃冰箱解冻，滤纸吸干表面血液和水分，以生理盐水为匀浆介质按照1：9的比例制成组织匀浆液，3 000 r/min 冷冻离心（4 ℃）10 min，取上清液用于过氧化氢酶（CAT）和总超氧化物歧化酶（T-SOD）测定。CAT 使用北京索莱宝科技有限公司检测试剂盒测定，T-SOD使用南京建成生物工程研究所有限公司试剂盒测定。

1.4.5 抗氧化及糖代谢相关基因表达量

肝脏总RNA 参照Trizol 试剂盒（Invitrogen，USA）提取，提取肝脏样品中的总RNA。然后利用Prime⁃ScriptTM反转录试剂盒将提取的总RNA 反转录为cDNA。反转录后检测cDNA浓度并用DEPC水稀释到200 ng/μL。分装后置于-20 ℃保存备用。利用已有的目的基因白细胞介素10（Interleukin-10，IL-10）、白细胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子α（Tu⁃mor necrosis factor α，TNF-α）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（Peroxisome proliferators-activated receptor α，PPARα）、脂肪酸合酶（Fatty acid synthase，FAS）、葡萄糖激酶（GK）、己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（PK）、6磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）和葡萄糖6磷酸酶（G6Pase）的引物序列合成引物，引物序列如表2所示。定量PCR体系为20 μL，其中2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL和7 μL超纯水。定量仪器为实时定量PCR 仪（Bio-Rad CFX96）。实时定量PCR 程序为94 ℃持续3 min；94 ℃持续15 s，退火温度58 ℃持续15 s，72 ℃持续20 s，共计40个循环。得到各基因的Ct值，并根据2-∆∆Ct方法测定目的基因的表达量。

表2 大口黑鲈抗氧化和糖代谢相关基因的实时定量PCR引物

1.5 数据统计与分析

采用SPSS 17.0（SPSS Incorporation，USA）统计软件对所得数据进行单因素方差分析（ANOVA），若差异显著（P<0.05），组间比较采用最小显著差法（LSD）进行多重比较分析。数据以“平均值±标准误”的形式表示。

2 结果与分析

2.1 新型植物提取物添加剂对大口黑鲈生长性能的影响（见表3）

如表3所示，经过8周的生长试验，试验组大口黑鲈增重率（WGR）和存活率均显著高于对照组（P<0.05）。饲料系数（FCR）则呈现相反的趋势（P<0.05）。

表3 新型植物提取物添加剂对大口黑鲈幼鱼生长性能的影响

2.2 新型植物提取物添加剂对大口黑鲈体组成的影响（见表4）

如表4所示，在本试验条件下，大口黑鲈体组织水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分含量各组间没有显著差异（P>0.05），但粗蛋白、粗脂肪有随着新型植物提取物添加剂添加呈升高的趋势。

表4 新型植物提取物添加剂对大口黑鲈幼鱼体成分的影响（%）

2.3 新型植物提取物添加剂对大口黑鲈血浆生化指标的影响（见表5）

表5 新型植物提取物添加剂对大口黑鲈血浆生化指标的影响

如表5所示，血浆总蛋白（TP）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）随着新型植物提取物添加剂添加而升高，高水平添加组（S3）显著高于对照组和低水平添加组（P<0.05）；低密度脂蛋白（LDL）和白蛋白（ALB）S3组显著高于对照组（P<0.05）。

2.4 新型植物提取物添加剂对大口黑鲈肝脏抗氧化能力的影响（见表6）

由表6 可知，在本试验条件下，大口黑鲈肝脏超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性随着新型植物提取物添加剂添加量升高显著下降（P<0.05）。

表6 新型植物提取物添加剂对大口黑鲈肝脏抗氧化酶活性的影响(U/mg prot.)

2.5 新型植物提取物添加剂对大口黑鲈肝脏炎症因子及肿瘤坏死因子基因表达的影响（见图1）

图1 新型植物提取物添加剂对大口黑鲈肝脏炎症相关基因相对表达量的影响

由图1 可知，肝脏炎症因子白细胞介素IL-10 和IL-1β在1 500 mg/kg 添加组表达显著上调（P<0.05），肿瘤坏死因子α（TNF-α）的表达在3 000 mg/kg新型植物提取物添加剂添加组显著下调（P<0.05）。

2.6 新型植物提取物添加剂对大口黑鲈糖脂代谢基因表达的影响（见图2～图3）

图2 新型植物提取物添加剂对大口黑鲈肝脏相关脂肪代谢基因相对表达量的影响

如图2、图3 可知，在本试验条件下，肝脏过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）、脂肪酸合酶（FAS）表达量在S2 组显著上调（P<0.05）。肝脏葡萄糖激酶（GK）、己糖激酶（HK）和6 磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）表达量在S2 组显著上调（P<0.05）。丙酮酸激酶（PK）、糖原磷酸化酶（GPase）和磷酸烯醇式丙酮酸激酶（PEPCK）表达量则随着新型植物提取物添加剂添加而显著升高（P<0.05）。

图3 新型植物提取物添加剂对大口黑鲈肝脏相关糖代谢基因GK、HK、G6PDH（A）；PK、G6Pase、PEPCK（B）相对表达量的影响

3 讨论

3.1 新型植物提取物添加剂对大口黑鲈生长性能的影响

近年来针对大口黑鲈碳水化合物代谢及其调控的研究已经成为行业热点。研究发现胆汁酸、肉碱等添加剂均能够通过促进大口黑鲈脂肪代谢、提高肝脏抗氧化能力起到促进大口黑鲈生长的效果[11-12]。本研究结果发现饲料中添加1 500、3 000 mg/kg 新型植物提取物添加剂能够显著提高大口黑鲈的成活率和生长性能。主要原因是新型植物提取物添加剂的作用机制与其组成有关，其组成中含有大量的桑叶黄酮和少部分功能性氨基酸，前期研究曾经发现桑叶黄酮在罗非鱼和凡纳滨对虾上均有一定的促生长作用[13-14]，而大菱鲆幼鱼因摄食功能性氨基酸后生长性能也大大提升[15]，以上研究结果与本文研究结果相同，说明桑叶黄酮和功能性氨基酸是调控生长作用的组成成分。

3.2 新型植物提取物添加剂对大口黑鲈抗氧化及炎症因子的影响

鱼类机体的健康情况与抗氧化水平高低有直接关系，与冰鲜鱼相比，含高碳水化合物的配合饲料导致大口黑鲈肝糖原含量升高，摄食率和增重率显著降低[16]，同时肝脏氧化应激严重[9]。本研究发现大口黑鲈肝脏SOD和CAT活性随新型植物提取物添加剂添加量升高呈显著下降，是由于桑叶黄酮和单宁酸的共同作用，缓解了大口黑鲈的肝脏氧化应激，在前期研究中，桑叶黄酮和单宁酸已被证实对哺乳动物、水产动物均有抗氧化作用[17-18]，与本研究结果一致。同样的作用也展现在胆汁酸添加剂中，其能够缓解由于高淀粉或高脂肪导致大口黑鲈肝脏氧化应激[19]。这些添加剂消除肝脏氧化应激的具体机制还值得进一步研究。

鱼体肝脏促炎和抗炎细胞因子基因的转录表达与植物提取物添加有关系[20]。适度高表达转录的促炎细胞因子有利于维持免疫平衡，增强抗感染能力[21]。添加剂调控促炎细胞因子高转录是否导致炎症或免疫调节目前尚未清楚，但植物提取物类似免疫兴奋剂，能够通过上调促炎细胞因子起到免疫调节的作用[22]。在本研究中，抗炎因子IL-10 和促炎因子IL-1β均表现出先上调再下调的趋势，特别是IL-1β与对照组相比上升4 倍。该结果与胆汁酸添加后的炎症因子反应类似[23]。但是与胆汁酸添加不同的是在新型植物提取物添加剂高剂量添加后TNF-α表达量显著下调，而胆汁酸是通过激活TNF-α起到改善大口黑鲈肝糖应激的作用[23]。这些差异背后的调控机制都值得深入研究和讨论。

3.3 新型植物提取物添加剂对大口黑鲈糖脂代谢的影响

胆汁酸作为市面上常见的鱼类饲料添加剂，对大口黑鲈氧化应激调控机制是激活肝脏胆汁酸-FXR信号通路，促进糖原合成，并使糖酵解、脂肪合成相关基因表达受到抑制[24]。同时，FXR通过诱导SHP的表达，抑制由肝脏X受体（LXR）/LRH所介导的SREBP-1c的反式激活，从而抑制脂肪生成相关基因的表达[25]。而本研究的结果则发现饲料中添加新型植物提取物添加剂能够显著促进大口黑鲈体内脂肪合成（FAS）和脂肪分解（PPARα）。同时，添加新型植物提取物添加剂上调糖原磷酸化酶（GPase）以及6磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）。这些结果说明新型植物提取物添加剂调节大口黑鲈糖脂代谢的作用机制是一种崭新途径，与市面上传统的胆汁酸添加剂是不同的。一方面，桑叶黄酮通过促进磷酸戊糖途径使部分体内葡萄糖转化为脂肪，同时通过上调PPARα促进体内脂肪的β氧化，从而使葡萄糖通过脂肪分解途径得到了利用。另一方面，单宁酸在一定水平时可以促进肝脏糖原分解，同时促进糖酵解的相关酶的表达，从而促进了糖酵解进行。本研究结果显示新型植物提取物添加剂添加后S2组GK 表达量上升近150倍，S3组上升约8 倍，糖酵解过程中HK、PK、PEPCK 都有不同程度上调表达。因此，新型植物提取物添加剂可通过影响糖酵解途径降低糖原积累，从而减轻大口黑鲈的肝糖应激。但新型植物提取物添加剂的添加量与糖代谢酶活性没有呈线性影响，可能是桑叶黄酮和单宁酸的复配结果对大口黑鲈糖酵解的调节作用仍是不充分的。这方面的作用机制值得进一步研究。

大口黑鲈作为典型肉食性鱼类，其糖异生水平更高[26]，而通过糖酵解分解葡萄糖和棕榈盐产生的ATP的能力非常有限。本研究结果显示，添加新型植物提取物添加剂促进了糖酵解和磷酸戊糖途径，对其糖异生关键酶PEPCK 也具有一定的表达促进作用。但是与糖酵解作用的促进相比，这种上调的效果是有限的。可以推测新型植物提取物添加剂作为一种生理活性成分，对大口黑鲈的机体调控是通过复杂的网络调控进行的，在消除大口黑鲈摄食碳水化合物后的一系列肝糖应激反应，如消除炎症因子、提高抗氧化能力、改善糖脂代谢途径等方面均具有一定的积极作用，从而起到促进大口黑鲈生长、改善大口黑鲈健康的作用。

4 小结

在本研究条件下，添加不同梯度的新型植物提取物添加剂能显著提高大口黑鲈的成活率和生长性能；新型植物提取物添加剂可通过影响糖酵解途径和磷酸戊糖途径，促进肝脏糖原分解，降低糖原积累，缓解大口黑鲈肝脏氧化应激。但因养殖条件受限，本养殖周期为8 周，虽然养殖效果明显，但较低于饲料源评价周期，因此新型植物提取物添加剂在更长的养殖周期内出现的效果还需要进一步探讨。