NRXN1基因和MECP2基因SNP检测及其与儿童自闭症临床表现的关联研究*

邹甜甜，李 胜，方欣怡，柯海燕，魏莉平，沈 翠

鄂东医疗集团黄石市妇幼保健院/湖北理工学院附属妇幼保健院:1.检验科;2.超声科，湖北黄石 435000

儿童自闭症又称孤独症，它是一种儿童时期广泛性发育障碍疾病，部分患儿常常与癫痫、精神发育迟滞、注意缺陷多动障碍、进食障碍等疾病共病，对儿童的身心健康造成严重的影响[1]。目前越来越多的研究学者在积极探索自闭症发病原因及机制，以期为早期干预及预防提供重要依据[2]。杨柳等[3]研究显示，CD157/BST-1基因rs4301112位点AG基因型和G等位基因可能与儿童自闭症谱系障碍发生风险及病情严重程度有关。许天友等[4]研究表明，GABRB3基因rs8179184位点CA、AA型与自闭症患儿的发病密切相关。据此推测儿童自闭症的发病可能与多种基因多态性有密切联系。神经轴突蛋白1(NRXN1)及其家族作为自闭症的候选致病基因已得到广泛的关注，且许多研究表明其基因变异会改变疾病的发病风险[5- 6]。甲基CpG结合蛋白-2(MECP2)是雷特综合征的致病基因，但其基因突变与其他神经系统发育障碍性疾病也有密切联系[7-8]。YUKA等[9]调查显示，包括NRXN1、MECP2在内的多种基因的罕见突变均与自闭症谱系障碍有关。本研究主要探讨128例自闭症患儿NRXN1基因(rs1421589位点)和MECP2基因(rs2239464位点)单核苷酸多态性(SNP)与自闭症发病风险的关联性。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性分析2019年9月至2021年6月于本院就诊或进行康复治疗的128例自闭症患儿(自闭症组)的临床资料，平均(5.34±2.32)岁，男88例，女40例；同期选取本院145例体检健康儿童作为对照组，平均(5.46±2.17)岁，男86例，女59例。纳入标准：(1)自闭症患儿由神经科医生依据第5版《诊断与统计手册：精神障碍》进行专业诊断；(2)临床资料齐全，且均为初次确诊；(3)所有儿童均为汉族人群；(4)研究经医院临床研究伦理委员会批准，家属签署书面知情同意书，健康儿童无多动症、智力障碍及自闭症等神经发育障碍类疾病。排除标准：(1)伴有先天性心脏病等严重先天性疾病及恶性肿瘤；(2)有厌食症或癔症等精神心理性疾病；(3)有重要脏器组织功能不全及其他遗传性疾病。

1.2仪器与试剂 聚合酶链反应(PCR)仪(型号：T100)购自美国Bio-Rad公司；紫外分光光度计(型号：A30221)购自美国Thermo Fisher公司。基因组DNA提取试剂盒(货号：D1800)购自上海晶风生物科技有限公司；Taq DNA polymerase(货号：RE0110-0.5kU)购自北京金克隆生物技术有限公司；PCR Buffer(货号：)购自瑞士Roche公司；dNTP溶液(货号：YS-10303RJ)购自上海雅吉生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1观察指标 采用孤独症儿童行为检查量表(ABC)评分测评患儿感觉、交往、语言、躯体运动、生活自理5个因子，共57个条目(228分)，分数超过53分可能患自闭症；超过67分可明确诊断自闭症。采用儿童孤独症评定量表(CARS)评分测评患儿病情严重程度，量表评分共60分，<30分为正常；30～<37分，且低于3分的项目不到5项为轻中度；37～60分，且至少5项评分高于3分为重度。

1.3.2NRXN1和MECP2基因型检测 采集患儿确诊后外周静脉血样，室温静置30～60 min，3 000 r/min离心15 min后收集上层血清，置于-80 ℃保存待测。参照DNA提取试剂盒说明书提取血清基因组DNA，提取后采用紫外分光光度计测定浓度及纯度。PCR用于扩增DNA，其体系包括：DNA模板 2.0 μL，上下游引物各0.5 μL，MgCl21.5 μL，dNTP 2.0 μL，PCR Buffer 2.5 μL，Taq DNA polymerase 0.2 μL，ddH2O 15.8 μL。反应条件均为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，45个循环，引物序列见表1。本研究基因分型由北京博淼生物科技有限公司采用Sequenom MassArray platform分型技术进行。

表1 PCR引物序列

2 结 果

2.1两组NRXN1基因和MECP2基因SNP基因型分布及Hardy-Weinberg(H-W)遗传平衡检验 对照组和自闭症组NRXN1基因在rs1421589位点上检出CC型、CT型、TT型3种基因型，对照组中CC型基因型(49.66%)比例较高，自闭症组中TT型基因型(57.81%)比例较高，经吻合度检验，对照组和自闭症组NRXN1基因SNP分布均符合Hardy-Weinberg平衡法则(χ2=1.386、5.069，P>0.05)；MECP2基因在rs2239464位点上检出AA型、AG型、GG型3种基因型，对照组中AA型基因型(50.34%)比例较高，自闭症组中GG型基因型(49.21%)比例较高，经吻合度检验，对照组和自闭症组MECP2基因SNP分布均符合Hardy-Weinberg平衡法则(χ2=4.297、5.508，P>0.05)。见表2、3。

表2 两组NRXN1基因(rs1421589位点)SNP基因型分布及H-W遗传平衡检验[n(%)]

表3 两组MECP2基因(rs2239464位点)SNP基因型分布及H-W遗传平衡检验[n(%)]

2.2NRXN1和MECP2各基因型与自闭症患儿临床行为的关系 NRXN1和MECP2不同基因型自闭症患儿感觉、交往、语言、躯体运动、生活自理得分及ABC总分比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4、5。

表4 NRXN1各基因型ABC得分比较分)

表5 MECP2各基因型ABC得分比较分)

2.3NRXN1和MECP2各基因型与自闭症患儿疾病严重程度的关系 NRXN1和MECP2不同基因型自闭症患儿疾病严重程度比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表6、7。

表6 NRXN1各基因型与自闭症患儿疾病严重程度的关系(n)

表7 MECP2各基因型与自闭症患儿疾病严重程度的关系(n)

2.4NRXN1和MECP2基因型影响自闭症发生的Logistic回归分析 将儿童自闭症是否发生作为因变量，校正年龄、性别、体质量指数等混杂因素后，分别以NRXN1基因的3种基因型(CC型、CT型、TT型)、MECP2基因的3种基因型(AA型、AG型、GG型)为自变量进行Logistic回归分析，结果显示TT型基因型(rs1421589位点)、GG型基因型(rs2239464位点)是影响自闭症发生的独立危险因素(P<0.05)。见表8、9。

表8 NRXN1基因型影响自闭症发生的Logistic回归分析

表9 MECP2基因型影响自闭症发生的Logistic回归分析

3 讨 论

自闭症的临床表现主要包括感觉、交往、语言、躯体运动、生活自理等方面的缺陷和障碍[10]。自闭症病因目前尚不十分明确，但许多证据表明其发生具有明显的遗传背景，认为先天性的基因异常与后天环境的相互作用可能是自闭症发病及表型多样化的重要因素[11- 12]。目前儿童自闭症尚缺乏有效的治疗方法，患儿往往预后较差，即使接受较好的训练也很难达到同龄儿童的发育水平，部分患儿甚至终生需要他人监护，加重家庭及社会的经济和精神负担[13]。

目前发现自闭症相关的多个基因中，许多与脑神经网络异常、突触功能等有关，表明神经元网络与自闭症的发病密切相关[14-15]。NRXN基因家族广泛表达于神经元中，可编码一类有多态性的细胞表面蛋白，参与细胞与细胞间的相互作用[16]。NRXN1基因可形成α-轴突蛋白和β-轴突蛋白，其中α-轴突蛋白参与细胞信号转导、功能性突触的形成及神经递质的释放[17]。MECP2最早发现于神经细胞内，主要存在于突触后区和神经元核内，在神经元发育、分化等过程中均有重要作用[18]。本研究中NRXN1基因rs1421589位点及MECP2基因rs2239464位点在自闭症患儿及健康儿童中均符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明所选样本均来自同一孟德尔群体，可进行群体遗传学研究。NRXN1基因rs1421589位点TT型自闭症患儿感觉、交往、语言等临床表现得分均高于CC型和CT型，同时MECP2基因rs2239464位点GG型患儿各临床表现得分高于AA型和AG型，且TT型及GG型基因型中重度患儿比例更高。提示NRXN1基因位点rs1421589 C-T突变和MECP2基因位点rs2239464 A-G突变可能与自闭症患儿的发病及严重程度有关。而戚小兵等[17]研究中，NRXN1基因rs1045881位点、rs11885814位点SNP与自闭症易感性无关，其与本研究结果的差异可能由所选位点不同导致，同时也可能与遗传异质性有关。TANTRA等[19]研究表明，MECP2基因rs2239464位点与攻击性社会行为有关，结合本研究结果中rs2239464位点SNP与自闭症的关系，进一步提示MECP2基因rs2239464位点可能与神经系统疾病有重要联系。此外，本研究中NRXN1基因rs1421589位点TT型基因型、MECP2基因rs2239464位点GG型基因型是影响自闭症发生的独立危险因素，进一步表明NRXN1基因(rs1421589位点)和MECP2基因(rs2239464位点)SNP可能参与自闭症的发生发展。

综上所述，NRXN1基因(rs1421589位点)和MECP2基因(rs2239464位点)SNP与自闭症的发生存在相关性，rs1421589位点TT型基因型、rs2239464位点GG型基因型可以增加儿童自闭症的发生风险及自闭症严重程度。但本研究同时存在一定的不足之处，样本选取受制于地区及人群，后续需扩大样本量进一步证实NRXN1基因和MECP2基因SNP与自闭症患儿发病及临床表现的相关性。