草本组方对γ 射线全身照射小鼠的保护作用

付海英 吴国忠

（中国科学院上海应用物理研究所 上海 201800）

根据世界卫生组织国际癌症研究机构发布的数据，2019 年和2020 年我国的癌症新发病例为393 万和456 万例［1］，这表明每天有超过1 万人确诊为癌症，除了常规的手术及化学治疗，约70%的患者接受放射治疗。这是由于放疗适应范围性广、治疗简便，约有40%的实体肿瘤可以用放疗根治［2］，因此放射治疗逐步成为治疗恶性肿瘤的主要手段之一。但是放射治疗是利用α、β、γ射线和各类X射线治疗机或加速器产生的X射线、电子线、质子束及其他粒子束对肿瘤进行局部治疗。患者在放射治疗时，临床上根据不同肿瘤的放射敏感性，确定患者接受放疗时的总剂量，如淋巴类肿瘤、肾母细胞瘤患者放疗的剂量为20～40 Gy，而大多数鳞癌、脑瘤患者的剂量约为60 Gy，单次放射性治疗的剂量为1～4 Gy［3‐4］。另外，利用X射线、超声和核素的γ射线等对病理变化进行判断的放射诊断已在医学影像领域被广泛应用，如CT具有密度分辨率高、可连续扫描等优点而被患者接受，但一次胸部CT，患者接受辐射当量剂量约2 mSv。不同组织器官和细胞对辐射表现出不同的敏感性，从而产生不同的辐射生物学效应。放射治疗或诊断时除了患病部位，正常的组织器官也会或多或少受到电离辐射照射，引起不同程度的副作用，影响患者的治疗效果和生活质量［5］。

辐射损伤的主要危害是对造血及血液系统的损伤［3］。机体受到辐射损伤后，对骨髓细胞的增殖产生抑制作用，造成细胞内生物大分子的剧烈分解，从而使某些造血细胞产生坏死，结果会降低骨髓的造血功能，出现造血系统的功能下降，同时也对血液系统的功能产生损害，使得如红细胞、白细胞、以及血小板等的数量出现不同程度的减少，最终导致各种并发症，如出血、感染、贫血等，对人体造成比较严重的损害。辐射损伤也会对机体免疫系统有损伤作用，出现免疫力低下现象。同时辐射损伤会产生过量的自由基，导致人体的生物防御系统遭受破坏。辐射防护剂首先在体外实验中被发现［3］，近几十年的发展，已经从最初的氨巯基类和色氨酸类防护剂，发展到毒性小的黄酮、多糖类合成药和天然中草药［6‐7］。前者可在机体受照射前短时间内给药有效，照射后给药无效，其毒副作用较大、有效时间短、有效剂量窄、口服效果不好。近年来，美国［5，8］、韩国［9‐10］、印度［11‐12］和中国［13‐15］等国家的科研工作者在此领域开展了大量研究，从人工合成氨磷汀、超氧化物歧化酶类药物逐渐过渡到从可食资源中提取维生素、黄酮类天然提取物。

天然草本提取物存在广泛，容易获取，且具有较强的抗氧化生物活性，又没有明显的毒副作用，近年来已逐渐成为各国研究筛选天然抗辐射防 护 剂 的 热 点［5，16］。研 究 表 明：黄 芪［17‐18］、当归［4，19］、肉苁蓉［20‐21］、白芍［22］等草本提取物含有的黄酮、苯乙醇苷、多糖等活性成分具有较强的抗氧化功效，能有效防护电离辐射造成的造血系统、血液系统、抗氧化系统及免疫系统损伤。由于单一组分天然提取物的水溶性差，单一使用时用量大。日本Aizawa等［23］利用芦丁、橙皮素、柚皮素等多种物质制备了复合防护剂，与单一组分相比，复合防护剂能更好地清除体内氧化性自由基，并修复X 射线照射后的造血功能。韩国Kim等［22］开发了白芍、川芎、当归等提取物作为辐射防护剂，研究了对小鼠经单次辐射3 Gy 或多次辐射7 Gy 后的喂养情况，系统比较了小鼠的免疫功能、造血机能变化，获得了一种能促进抗癌，提高免疫力和造血功能，保护机体免于氧化损伤的草本复合物，基于该专利的产品，Hemo Him已商业化，为肿瘤患者放射性治疗时辅助使用。

本实验研究C57BL/6 成年小鼠在受到辐射损伤（一次性全身照射4 Gy）后，利用黄芪、当归、肉苁蓉、槐米、白芍等提取物制备草本组方进行灌胃干预，同时以市场上购买的Hemo Him产品作为对照组（Hemo‐1#）进行对比，比较不同配方草本组方对小鼠造血功能的修复，评价其防辐射功效，为进一步研发天然辐射防护剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

60Co γ 射线辐射源，中国科学院上海应用物理研究所，剂量率0.067 Gy/min；全自动动物血液细胞分析仪，BC‐2800Vet，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；电子天平，ML503/02，梅特勒‐托利多仪器（上海）有限公司，精度1 mg；真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。

1.2 材料

草本提取物均由陕西省某科技发展有限公司提供。黄芪提取物，棕褐色粉末；槐米提取物，黄色粉末，含曲克芦丁98%；阿拉善肉苁蓉提取物，黑色纯粉；当归提取物，黄褐色粉末；白芍提取物，黄褐色粉末。

1.3 药品配制

粉末样品用自封袋密封后，经60Co γ射线照射4 kGy灭菌后，样品保存于真空干燥箱内。草本组方的制备：经照射后的各提取物分别加入一定量的去离子水，于50°C的热水浴中超声震荡2 h，过滤除去不溶物。按等比例配置成质量分数均为12%的混合物样品Exp‐2#和Exp‐3#，其中Exp‐2#为当归、白芍、肉苁蓉、槐米的草本混合物；Exp‐3#为当归、白芍、肉苁蓉、槐米、黄芪的草本混合物。对照组Hemo‐1#直接使用商业产品Hemo Him。

2 动物

小鼠品系：C57BL/6，周龄：6～8 周，性别：雌雄各半，体重：（20±2）g，来源：菲诺克生物科技（上海）有限公司。实验环境温度为（22±2）°C，相对湿度为（50±10）%。动物实验在菲诺克生物科技（上海）有限公司完成。

2.1 分组与处理

56只成年小鼠，随机分为4组，每组雌雄性小鼠各7 只：照射空白组（Blank）、1 组市售产品对照组（Hemo‐1#）、2组不同配方实验组（Exp‐2#和Exp‐3#）。除照射空白组的小鼠给予200 μL的蒸馏水灌胃处理外，其余三组照射前3 d开始给药，每天灌胃剂量均为200 μL，照射当天不给药；照射后，继续给药21 d。连续喂养3 d 后，4 组小鼠用60Co γ 射线全身一次性照射，吸收剂量率0.067 Gy/min，总吸收剂量4 Gy。

2.2 小鼠体重的变化

观察指标。（1）整体状况：每天密切观察各组小鼠的外观皮毛、活动情况、摄食变化、体型及精神状态变化。（2）体质量：每只小鼠每天灌胃前称量并记录体重，以各组平均体重为纵坐标，称重天数为横坐标，绘制体重变化曲线，观察灌胃给药对小鼠体重的影响。

2.3 外周血象分析

小鼠照射后第1 天，于灌胃后1 h，眼球采血30 μL左右，吸入肝素抗凝管，采用自动血球分析仪测外周血白细胞和淋巴细胞数量，各组分别于照射后第4、7、14 和21 天再测全血白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、血小板（PLT）和淋巴细胞（Lymph）计数。

2.4 统计学处理

采用SPSS（Version 17.0）软件对数据进行统计分析，结果以平均值±标准方差（means±SD）表示，组间差异采用t检验。以显著性差异p＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果与讨论

3.1 体重变化

照射前3 d 开始对Hemo‐1#、Exp‐2#和Exp‐3#组小鼠给药，观察到小鼠出现软便，体重为（23.3±0.8）g，保持不变，活动正常。照射后第4天，小鼠软便消失，说明小鼠对草本混取物适应性为7 d左右。

γ射线照射后小鼠体重变化曲线见图1。由图1可知，受照射后小鼠的体重均下降，Exp‐3#组小鼠体重变化最为明显，到第4天体重下降到最低，约降低10%。实验过程中，Hemo‐1#组小鼠体重变化趋势与Blank组最为接近，变化幅度小，体重增长比较平稳，而两个配方Exp‐2#和Exp‐3#组的小鼠体重变化均起伏较大。照射后第14天，4组小鼠的体重均趋于稳定。实验中喂养草本组方对小鼠体重的促进效果并不明显，可能与小鼠对药物的适应性有关。

图1 草本组方对照射小鼠体重变化Fig.1 Changes of the body weight after γ‐ray irradiation

3.2 白细胞和淋巴细胞计数

白细胞作为机体免疫调节和免疫效应细胞，对辐射有极高的敏感性，极易受到辐射的影响而发生DNA 的断裂，细胞形态和功能以及细胞数量改变，因而白细胞计数已被用来作为辐射损伤程度的评估指标。

未受到照射的正常8周龄C57BL/6小鼠的白细胞计数为（4.8±0.6）×109L-1，而照射空白组照射后第1 天，外周血白细胞计数为（1.0±0.1）×109L-1，表明照射后小鼠白细胞数量急剧下降，约为正常小鼠白细胞数量的20.8%。给药的3 组小鼠白细胞数量较正常小鼠也下降，但均高于照射空白组。照射后第4 天，Hemo‐1#组的白细胞数量平稳上升，而实验的两组Exp‐2#和Exp‐3#起伏较大。

图2（b）中淋巴细胞与白细胞趋势一致，小鼠经4 Gy 照射后第1 天，外周淋巴细胞受到严重损伤，数量急剧下降。给药的Hemo‐1#、Exp‐2#和Exp‐3#组淋巴细胞数量有所降低，但均高于Blank组。而照射后第4天，两实验组无论白细胞还是淋巴细胞计数都出现急剧下降，推测小鼠对草本组方存在4～7 d的适应性。到第7天，均逐步恢复。

图2 草本组方对照射小鼠白细胞计数(a)和淋巴细胞计数(b)的影响Fig.2 Effects of herb formulas on the leukocyte counts(a)and lymph counts(b)for mice irradiated

3.3 血小板计数

血小板在止血和凝血过程中起重要作用，当血管受损伤或破裂时，血小板受刺激，由静止相变为机能相，迅即发生变形，表面黏度增大，凝聚成团；同时，在表面第Ⅲ因子的作用下，使血浆内的凝血酶原变为凝血酶，后者又催化纤维蛋白原变成丝状的纤维蛋白，与血细胞共同形成凝血块止血，血小板颗粒物的释放则进一步促进止血和凝血。

血小板寿命为10 d 左右，未受到辐射损伤的成熟巨核细胞可生成血小板。图3显示外周血中血小板在照后缓慢下降，照射后第7天最为明显，但均在正常范围，此后逐步恢复。

图3 草本组方对照射小鼠血小板计数的影响Fig.3 Effects of herb formulas on the PLT counts for mice irradiated

3.4 红细胞及血红蛋白含量

动物造血系统对电离辐射极为敏感，一定剂量射线作用后，可引起外周血象及各类血细胞不同程度的变化。一般认为，射线对成熟血细胞的直接杀伤效应不大，但可导致幼稚造血细胞数量急剧减少，增殖功能明显下降，结果外周血中成熟血细胞来源匮乏，加上死亡加速，导致全血细胞减少。事实上，造血系统的损伤是辐射对机体最直接、最典型的生物学效应表现。

成熟红细胞的寿命是120 d，每天以1%的速度更新，所以照射后早期红细胞和血红蛋白的变化不大，随后逐渐减少；照射处理后第4天小鼠外周血的血红蛋白显著减少，且持续在较低的含量。

照射后第1 天及照射后第14 天，血红蛋白的含量出现异常（图4（b）），超出小鼠血红蛋白正常范围110～143 g/L，可能是因为全身照射4 Gy 的剂量对小鼠的心肺等脏器造成较严重的损伤。

图4 草本组方对照射小鼠红细胞(a)和血红蛋白(b)含量的影响Fig.4 Effects of herb formulas on the RBC(a)and HGB(b)level for irradiated mice

进一步比较γ射线照射后，利用草本组方持续喂养21 d，小鼠体重及血象指标如表1所示。可以看出，照射后第1天，小鼠白细胞、淋巴细胞、红细胞、血小板计数和血红蛋白含量的下降说明电离辐射引起了小鼠造血机能损伤，给药对照组Hemo‐1#、Exp‐2#和Exp‐3#可不同程度减缓照射小鼠白细胞、淋巴细胞的下降幅度。持续喂养21 d后，4 组小鼠血象指标白细胞、淋巴细胞、红细胞、血小板计数和血红蛋白含量均趋于正常。同时研究过程中也观察到血红蛋白含量超出正常范围，推测4 Gy 的剂量导致小鼠脏器部分受损，一次剂量对小鼠损伤的影响有待进一步研究。

表1 草本组方对照射后小鼠血常规指标Table 1 Changes of conventional indicators of peripheral blood after γ-ray irradiation (n=14）

4 结论

本研究采用黄芪、当归、白芍、肉苁蓉等天然提取物配置草本组方，应用于γ射线全身照射的小鼠，观察其对照射前后小鼠体重、血象的影响，结果表明：4 Gy γ射线照射成年小鼠，导致小鼠白细胞、淋巴细胞、红细胞、血小板和血红蛋白含量的下降，说明电离辐射引起了小鼠造血机能的损伤，给药后逐步恢复：照射后第7 天，白细胞、红细胞和淋巴细胞恢复正常。两给药组与市售产品Hemo‐1#比较，对小鼠体重影响、血象指标的恢复基本相当，但与Blank 组相比，差异均不显著。实验配方组Exp‐2#与Exp‐3#相比，照射后小鼠体重稳定增长，Exp‐3#组出现波动起伏大，Exp‐2#组血象指标数值也略优于Exp‐3#组。综合考虑，该草本组方含有多种提取物，其活性成分多，具有一定的辐射保护效果。但本研究仅选择韩国商业产品Hemo Him作对比，获得了相近的结果，后续需在组方活性成分、吸收剂量、受照射后骨髓干细胞、DNA 氧化性损伤等方面开展更为系统的研究，为多方位评价草本组方的应用提供依据。

作者贡献说明 付海英是本研究工作的实验执行人，完成数据采集与分析，论文初稿的写作，参与实验设计和结果分析；吴国忠是项目的构思者及负责人，指导实验设计、论文写作与修改。二位作者都阅读并同意最终的文本。