miR-138-5p 靶向调控程序性死亡配体-1对肺腺癌细胞的增殖、迁移和上皮间质转化的影响*

梁青松，贾军，胡欣，罗晖△

（南充市中心医院 1.胸心外科；2.呼吸内科；3.肿瘤科，南充 637000）

肺癌是临床常见的恶性肿瘤，其死亡率位于恶性肿瘤首位。肺腺癌是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中的一种常见类型，由于细胞增殖、迁移较快，侵袭性强，导致患者5年生存率较低，研究其发生和发展的分子机制，探寻靶向分子药物具有重要意义[1- 2]。微小RNA-138-5p（miR-138-5p）在胃癌[3]、前列腺癌[4]、肝癌[5]等肿瘤中低表达，参与调控肿瘤细胞的增殖、迁移、上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、血管生成等。研究显示，miR-138-5p在NSCLC中表达下调，与肿瘤TNM分期、肿瘤直径、淋巴结转移及患者预后有关[6]；miR-138-5p可靶向下调程序性死亡配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）激活免疫系统抑制NSCLC肿瘤生长[7]。PD-L1为PD-1配体，具有负性调控免疫反应的作用，在肿瘤中高表达，与肿瘤免疫逃逸有关[8]。miR-138-5p是否通过靶向调控PD-L1影响肺腺癌细胞的增殖、迁移和EMT，目前尚不清楚。本研究旨在探索miR-138-5p对肺腺癌细胞（H1299）增殖、迁移及EMT的影响，并进一步阐明其作用机制。

1 材料与方法

1.1细胞、主要试剂与仪器 人支气管上皮细胞（BEAS-2B）、人肺腺癌细胞（H1299、HCC827、A549、H1975）购于中国科学院细胞库；DMEM培养基（12800017）、胎牛血清（10099141）购自美国Gibco公司；miR-138-5p过表达质粒（miR-138-5p mimics）及阴性对照（miR-NC）、PD-L1过表达质粒（PDL1）及空载质粒（pcDNA）、抑制PD-L1表达（si-PD-L1）及阴性对照（si-NC）质粒及miR-138-5p、U6引物购自上海生工生物工程股份有限公司；RNA提取试剂（10296010）、Lipofectamine 2000（11668-019）购自Invitrogen公司；RIPA细胞裂解液（P0013B）、双荧光素酶报告基因检测试剂盒（RG005）、CCK-8试剂盒（C0037）购自碧云天生物技术有限公司；兔抗人PDL1（ab243877）、PCNA（ab92552）、MMP-9（ab228402）、E-cadherin（ab40772）、N-cadherin（ab76011）、山羊抗兔IgG H&L（HRP）（ab205718）抗体购自Abcam公司。MK3型全自动酶标仪、ABI 7500荧光定量PCR仪购自美国Thermofisher公司；CKX31型倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司；K8500凝胶成像系统购自南京世研仪器。

1.2标本来源 选择2019年3月至2021年5月在本院手术治疗的肺腺癌患者42例，其中男29例，女13例，年龄35～78岁，平均（54.50±9.70）岁，手术过程中取肺腺癌组织与癌旁组织，置于-80℃冰箱中保存，患者术前未曾接受放、化疗。本研究经本院伦理委员会批准，患者知情并同意。

1.3细胞培养及转染 使用含有10%胎牛血清的DMEM培养基 培养BEAS-2B、H1299、HCC827、A549、H1975细胞。将H1299细胞接种于6孔板中（2×105个细胞/孔），待细胞生长融合至70%～80%时，使用Lipofectamine 2000进行质粒转染，将H1299细胞分为Control组、miR-NC组、miR-138-5p mimics组、si-NC组、si-PD-L1组、miR-138-5p mimics+pcDNA组和miR-138-5p mimics+PD-L1组，每组设置6个复孔，转染6 h后更换新鲜DMEM培养基继续培养48 h，用于后续实验。

1.4双荧光素酶报告基因实验 根据生物信息学软件（genecards）在线预测显示，miR-138-5p与PDL1 3’UTR有结合区域，分别构建野生型PD-L1-WT或突变型PD-L1-MUT质粒，将对数生长期的H1299细胞接种于24孔板中培养24 h后，取上述质粒分别与miR-138-5p mimics、miR-NC共转染H1299细胞48 h，双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定相对荧光素酶活性。

1.5实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测miR-138-5p水平 采用RT-qPCR法检测肺腺癌组织、癌旁组织及肺腺癌细胞、支气管上皮细胞中miR-138-5p相对表达量。miR-138-5p上游引物（5’-3’）：GCGAGCTGGTGTTGTGAATC，下游引物（5’-3’）：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT；U6上游引物（5’-3’）：CTCGGCTTCGGCAGCACA，下游引物（5’-3’）：AACGCTTCACGAATTTGCGT。miR-138-5p扩增条件：95℃，5 min孵育；94℃，15 s变性，60℃，30 s退火，70℃，45 s延伸，40个循环。以U6为内参，采用2-△△CT法计算miR-138-5p相对表达量。

1.6 CCK-8法检测细胞增殖 转染后的生长良好的H1299细胞以每孔1×105个细胞接种至96孔板中，于37℃，5% CO2培养箱中培养，于24 h、48 h、72 h时间点，每孔加入10µL的CCK-8溶液继续孵育2 h后，全自动酶标仪检测450 nm处吸光度（OD450 nm）值。

1.7划痕实验检测细胞迁移 取转染48 h的H1299细胞，以每孔1×104个细胞接种至6孔板中，待细胞完全贴壁后，使用200μL移液器枪头在每孔垂直划线，PBS洗去漂浮细胞，在37℃、5%CO2培养箱培养24 h后，倒置显微镜下观察，并计算划痕愈合率，划痕愈合率=（0 h划痕宽度-24 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。

1.8免疫印迹法（western blotting）检测细胞中PDL1、PCNA、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达 收集转染后的H1299细胞，加入200μL RIPA细胞裂解液制备细胞裂解物，离心取上清液，使用BCA试剂盒检测蛋白浓度，经SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加PDL1（1∶1 000）、PCNA（1∶1 500）、MMP-9（1∶2 000）、E-cadherin（1∶1 500）、N-cadherin（1∶1 000）一抗和βactin（1∶1 000）抗体，4℃孵育过夜，TBST洗涤，加入相应二抗（1∶2 000）室温孵育2 h，凝胶成像系统成像，以β-actin为内参，使用Image-Pro Plus 6.0软件分析蛋白相对表达量。

1.9统计学方法 采用统计学软件SPSS 22.0对数据进行分析，GraphPad Prism7.0软件绘制生长曲线，计量资料用均数±标准差（）描述，两组间比较行t检验，多组间比较及进一步两两比较分别行单因素方差分析和SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-138-5p在肺腺癌组织与细胞中表达下调

RT-qPCR检测结果显示，miR-138-5p在肺腺癌组织中表达水平低于癌旁组织（P＜0.05），肺腺癌H1299、HCC827、A549、H1975细胞中miR-138-5p表达水平低于BEAS-2B细胞，见图1，其中H1299细胞中表达水平最低，选择H1299细胞用于后续实验。

图1 miR-138-5p在肺腺癌组织与细胞中的表达

2.2 miR-138-5p与PD-L1靶向关系验证 经数据库（genecards）在线预测发现，miR-138-5p与PD-L1 mRNA 3’UTR区有结合位点（图2）。双荧光素酶报告基因检测结果显示，miR-138-5p mimics和miRNC分别与野生型PD-L1质粒共转染H1299细胞后，与miR-NC组相比，miR-138-5p mimics组荧光素酶活性显著降低，见图3，证明miR-138-5p与PD-L1存在靶向关系。

图2 miR-138-5p与PD-L1靶向关系验证

2.3过表达miR-138-5p对H1299细胞增殖、迁移、EMT及PD-L1表达的影响Control组和miR-NC组H1299细胞增殖、划痕愈合率及PD-L1、PCNA、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达水平比较，差异无统计学意义；与miR-NC组相比，miR-138-5p mimics组H1299细胞增殖、划痕愈合率及PD-L1、PCNA、MMP-9、N-cadherin蛋白表达水平降低，miR-138-5p、E-cadherin表达水平升高，见表1和图3。

图3 过表达miR-138-5p对H1299细胞增殖、迁移、EMT的影响

表1 过表达miR-138-5p对H1299细胞增殖、迁移、EMT的影响 ，n=6

表1 过表达miR-138-5p对H1299细胞增殖、迁移、EMT的影响 ，n=6

与miR-NC组比较，aP＜0.05。

2.4抑制PD-L1表达对H1299细胞增殖、迁移及EMT的影响H1299细胞转染si-PD-L1质粒后，Control组和si-NC组H1299细胞增殖、划痕愈合率及PD-L1、PCNA、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达水平比较，差异无统计学意义；与si-NC组相比，si-PD-L1组H1299细胞增殖、划痕愈合率及PDL1、PCNA、MMP-9、N-cadherin蛋白表达水平降低，E-cadherin蛋白表达水平升高，见表2和图4。

图4 抑制PD-L1表达对H1299细胞增殖、迁移及EMT的影响

表2 抑制PD-L1表达对H1299细胞增殖、迁移及EMT的影响 ，n=6

表2 抑制PD-L1表达对H1299细胞增殖、迁移及EMT的影响 ，n=6

与si-NC组比较，aP＜0.05。

2.5过表达PD-L1可逆转过表达miR-138-5p对H1299细胞增殖、迁移及EMT的抑制作用将PDL1过表达质粒与miR-138-5p mimics质粒共转染H1299细胞后，与miR-138-5p mimics+pcDNA组相比，miR-138-5p mimics+PD-L1组H1299细胞增殖、划痕愈合率及PD-L1、PCNA、MMP-9、N-cadherin蛋白表达水平升高，E-cadherin蛋白表达水平降低，表明过表达PD-L1可部分逆转过表达miR-138-5p对H1299细胞增殖、迁移及EMT的抑制作用，见表3和图5。

图5 同时过表达miR-138-5p与PD-L1对H1299细胞增殖、迁移及EMT的影响

表3 同时过表达miR-138-5p与PD-L1对H1299细胞增殖、迁移及EMT的影响 ，n=6

表3 同时过表达miR-138-5p与PD-L1对H1299细胞增殖、迁移及EMT的影响 ，n=6

与miR-138-5p mimics+pcDNA组相比，aP＜0.05。

3 讨论

miRNAs可作为致癌基因或抑癌基因参与调控肺腺癌的发生、转移或肿瘤细胞耐药性等过程，与肺腺癌的发生和发展密切相关，其中miR-138-5p在多种肿瘤中表达下调，发挥抑癌基因的作用，如miR-138-5p在胃癌、结肠癌、乳腺癌等肿瘤中低表达，调控肿瘤细胞的侵袭、迁移与肿瘤耐药性[9-11]。已有研究显示，miR-138-5p在肺癌中表达下调，过表达miR-138-5p可靶向叉头框蛋白C1（FOXC1）抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[12]。本研究结果亦显示，miR-138-5p在肺腺癌组织与细胞中表达下调。EMT是恶性肿瘤细胞发生局部浸润与远处转移的关键；N-cadherin为上皮细胞标志物，其水平升高有利于血管形成及上皮—间质细胞的迁移；E-cadherin可维持细胞间极性，抑制细胞的迁移，二者在EMT过程中发挥重要作用，而MMP-9可诱导EMT[13]。为探索miR-138-5p对肺癌细胞的影响，本研究将miR-138-5p过表达质粒转染H1299细胞发现，与miR-NC组相比，miR-138-5p mimics组H1299细胞增殖、划痕愈合率及PCNA、MMP-9、N-cadherin蛋白表达水平降低，miR-138-5p、E-cadherin表达水平升高。表明过表达miR-138-5p可抑制H1299细胞增殖、迁移及EMT，提示miR-138-5p在肺腺癌发生和发展中发挥抑癌作用。魏丽等[13]研究表明，眼葡萄膜黑色素瘤细胞中，过表达miR-138-5p可靶向抑制转录因子4（TCF4）表达，从而抑制细胞增殖、侵袭及EMT。

PD-L1属于一种负性共刺激分子，为PD-1配体，在免疫细胞、上皮细胞及血管内皮细胞均有表达，PD-L1与PD-1结合，下调淋巴细胞增殖，导致其效应T细胞凋亡，发生肿瘤免疫逃逸，促进肿瘤生长[14]。研究显示，PD-L1在肝癌、胃癌、肺腺癌中的表达上调，与肿瘤的免疫耐受和免疫逃逸发生密切相关[15-16]。研究显示，PD-L1在肺腺癌组织中呈高表达，与疾病分化程度、有无淋巴结转移、TNM分期和CD8+T淋巴细胞相关[17]。研究表明，在结肠癌细胞中，过表达miR-138-5p可靶向抑制PD-L1表达，抑制细胞增殖，且在体内可抑制小鼠肿瘤的生长[18]。本研究双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-138-5p与PD-L1存在靶向关系，且在H1299细胞中，miR-138-5p的上调可抑制PD-L1表达，进一步证实二者的靶向关系。本研究通过在H1299细胞中转染si-PD-L1质粒下调PD-L1表达后，H1299细胞增殖、划痕愈合率及PD-L1、PCNA、MMP-9、N-cadherin蛋白表达水平降低，E-cadherin表达水平升高，表明抑制PD-L1表达可显著抑制H1299细胞增殖、迁移和EMT。而过表达PD-L1可部分逆转过表达miR-138-5p对H1299细胞增殖、迁移与EMT的抑制作用。以上这些结果表明，过表达miR-138-5p可通过靶向抑制PD-L1表达，抑制H1299细胞增殖、迁移与EMT。

综上所述，miR-138-5p在肺腺癌组织与细胞中表达下调，过表达miR-138-5p可通过靶向抑制PDL1表达而抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移和EMT。本研究仅对相关机制进行了初步研究，其涉及的相关分子通路仍需进一步研究。