整合素连接激酶和黏着斑激酶在宫颈癌组织中的表达及其与人乳头瘤病毒感染的关系

李晓丹，费晓莺，韩 敏，张香玲，赵 静

(1.邯郸市第一医院妇科，河北 邯郸 056002；2.邯郸市第一医院手术室，河北 邯郸 056002)

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其最常见的病理类型是宫颈鳞状细胞癌(cervical squamous cell carcinoma,CSCC)，CSCC约占宫颈癌的75%～80%[1]。研究表明，人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染是宫颈癌的主要危险因素之一[2]，宫颈上皮内瘤病(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)是宫颈癌的癌前病变，因此，预防HPV感染对降低宫颈癌发病率具有重要意义。整合素连接激酶(integrin linked kinase,ILK)是一种细胞内蛋白激酶，其在整合素、生长因子信号传导通路中发挥重要作用，参与调控细胞增殖、生长、分化、迁移、浸润及肿瘤血管生成等过程[3]。黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是生长因子受体和整合素介导信号的关键调节因子，可通过其激酶活性和支架功能调控正常及癌细胞的基本过程[4]。本研究旨在探讨ILK和FAK的表达与宫颈癌患者临床病理特征和HPV感染的关系。

1 资料与方法

1.1 组织标本来源选择2015年10月至2019年8月邯郸市第一医院保存的30例正常宫颈组织(对照组)、30例CIN组织(CIN组)和60例CSCC组织标本(CSCC组)为研究对象，纳入对象均经病理学检查明确诊断，病历资料完整，且排除患有其他系统肿瘤及可能有影响本研究结果的不利因素者。CIN和宫颈癌患者中HPV-DNA阳性75例，HPV-DNA阴性15例。对照组、CIN组和CSCC组患者的年龄分别为41～76(58.36±9.24)、40～76(57.86±9.35)、42～77(59.46±9.63)岁，3组患者的年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究通过医院医学伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。

1.2 主要试剂TRIzol试剂盒购自美国Invitrogen公司，cDNA合成试剂盒购自美国Promega公司，SYBR-green实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)试剂盒购自美国Thermo Scientific公司，抗ILK、抗FAK抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组织化学试剂盒、二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)显色剂购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 实时荧光定量PCR法检测正常宫颈组织、CIN组织和CSCC组织中ILK、FAK mRNA的表达取正常宫颈组织、CIN组织和CSCC组织，TRIzol 法提取总 RNA，溶于焦碳酸二乙酯水，测定浓度与纯度；以cDNA为模板，进行荧光定量PCR；引物序列：ILK的上游引物序列为5′-GCACTCAATAGCCGTAGTG-3′，下游引物序列为5′-CCTACTTGTCCTGCATCTTC-3′；FAK的上游引物序列为5′-GCGTCTAATCCGACAGCA-3′，下游引物序列为5′-GCCGACTTCCTTCACCAT-3′；内参β-actin的上游引物序列为5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′,下游引物序列为5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性35 s，60 ℃退火30 s，72 ℃扩增30 s，30个循环；72 ℃延长5 min。采用2-ΔΔCt法计算正常宫颈组织、CIN组织和CSCC组织中ILK、FAK mRNA的相对表达量。实验重复3次，取均值。

1.4 免疫组织化学法检测正常宫颈组织、CIN组织、CSCC组织中ILK和FAK蛋白的表达取正常宫颈组织、CIN组织和CSCC组织，40 g·L-1多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片(厚度约为5 μm)，置于40 ℃温水中，待组织受热展开，应用载玻片捞起，植入37 ℃温箱中烘干；二甲苯、梯度乙醇脱蜡与水化处理；微波抗原修复，胰蛋白酶消化；磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)冲洗3次，每次5 min；滴加体积分数4 %羊血清封闭30 min；滴加一抗(滴度1100)，4 ℃过夜；PBS冲洗3次，每次5 min；滴加二抗(滴度1200)，孵育30 min；PBS冲洗3次，每次5 min；DAB显色，苏木精复染；脱水，透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察。ILK、FAK蛋白表达于细胞膜和(或)细胞质，黄色、棕黄色、棕褐色。高倍镜下(×200)每张切片随机选取5个视野，采用半定量方法判断，根据阳性细胞染色强度和阳性细胞所占百分比进行评分。阳性细胞所占百分比评分：阳性细胞率<5%计0分，5%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分。染色强度评分：未着色计0分，黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。以阳性细胞染色强度评分与阳性细胞所占百分比评分的乘积为最终综合评分，综合评分≥5判定为阳性(+)，<5分判定为阴性(-)。

2 结果

2.1 正常宫颈组织、CIN组织和CSCC组织中ILK、FAK mRNA表达比较结果见表1。CIN组织和CSCC组织中ILK、FAK mRNA的相对表达量显著高于正常宫颈组织，CSCC组织中ILK、FAK mRNA的相对表达量显著高于CIN组织，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 正常宫颈组织、CIN组织和CSCC组织中ILK、FAK mRNA的表达比较

2.2 正常宫颈组织、CIN组织和CSCC组织中ILK、FAK蛋白表达比较正常宫颈组织中ILK、FAK蛋白阳性表达率分别为6.67%(2/30)、3.33%(1/30)，CIN组织中ILK、FAK蛋白阳性表达率分别为63.33%(19/30)、56.67%(17/30)，CSCC组织中ILK、FAK蛋白阳性表达率分别为85.00%(51/60)、71.67%(43/60)；CSCC组织中ILK、FAK蛋白阳性表达率显著高于CIN组织和正常宫颈组织，CIN组织中ILK、FAK蛋白阳性表达率显著高于正常宫颈组织，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.3 ILK和FAK蛋白表达与CSCC临床病理特征的关系结果见表2。ILK和FAK蛋白表达与CSCC的临床分期、淋巴结转移有关(P<0.05)，而ILK和FAK蛋白表达与CSCC患者年龄无关(P>0.05)。

表2 ILK和FAK蛋白表达与CSCC患者临床病理特征的关系

2.4 ILK和FAK蛋白表达与HPV感染的关系HPV-DNA阳性者ILK蛋白阳性表达率为86.67%(65/75)，HPV-DNA阴性者ILK蛋白阳性表达率为33.33%(5/15)；HPV-DNA阳性者ILK蛋白阳性表达率显著高于HPV-DNA阴性者，差异有统计学意义(χ2=20.070，P<0.05)。HPV-DNA阳性者FAK蛋白阳性表达率为76.0%(57/75)，HPV-DNA阴性者FAK蛋白阳性表达率为20.0%(3/15)；HPV-DNA阳性者FAK蛋白阳性表达率显著高于HPV-DNA阴性者，差异有统计学意义(χ2=15.990，P<0.05)。

3 讨论

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，HPV是致癌过程中的主要致病因素，约70%的宫颈癌和50%的CIN 3期病变是由于HPV16或HPV18的持续感染引起的[5-7]。FAK是一种典型的多功能蛋白，其通过整合素或生长因子受体将信号整合和转导到癌细胞中。有研究显示，ILK在宫颈癌组织中过表达，且与肿瘤分级、侵袭和转移有关，其也是淋巴结转移的独立预测因子[8]。本研究旨在探讨FAK和ILK在CIN和CSCC中的表达及其与CSCC临床病理特征、HPV感染的相关性，以期为宫颈癌的临床诊断与治疗提供依据。

本研究结果显示，CIN组织和CSCC组织中ILK、FAK mRNA的相对表达量显著高于正常宫颈组织，CSCC组织中ILK、FAK mRNA的相对表达量显著高于CIN组织；CSCC组织中ILK、FAK蛋白阳性表达率显著高于CIN组织和正常宫颈组织，CIN组织中ILK、FAK蛋白阳性表达率显著高于正常宫颈组织；且ILK和FAK蛋白表达与CSCC的临床分期、淋巴结转移有关；提示ILK和FAK可能参与了CSCC的发生和发展。FAK参与肿瘤血管的信号转导过程，介导血管通透性[9-11]，FAK和ILK可通过磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B信号通路共同促进肿瘤的侵袭和转移[11]。研究显示，高危型HPV持续感染会导致宫颈癌前病变甚至宫颈癌[12-13]。本研究结果显示，HPV-DNA阳性者ILK、FAK蛋白阳性表达率显著高于HPV-DNA阴性者，提示ILK和FAK蛋白表达可能与HPV感染有相关性。整合素介导细胞与细胞外基质的黏附，并刺激参与细胞增殖、存活和迁移的信号传导，ILK在整合素、生长因子信号传导通路中发挥重要作用，FAK基因被认为是整合素介导的信号传导的核心基因[14-15]。

综上所述，ILK、FAK在CSCC组织中呈高表达，且ILK和FAK蛋白表达与CSCC病变程度及HPV感染有相关性，ILK、FAK可能参与了CSCC的发生和发展，其具体机制尚有待进一步研究。