基于TLR4/NF-κB炎性轴探讨针灸联合感觉运动训练对膝骨关节炎模型大鼠运动能力的改善作用*

赵玉伟，刘志昂，车文生，孙晓东

郑州人民医院，河南 郑州 450000

膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是一种常见的退行性疾病，可引发膝关节疼痛、骨性膨大、晨僵等症状，为慢性致残首要因素[1]。KOA治疗包括保守治疗、手术治疗，其中保守治疗以药物、物理疗法为主，相对于药物、手术治疗，人们更易接受物理治疗。近年来，运动训练已逐渐成为康复医学领域一个常用手段，对缓解KOA症状有一定作用[2-3]；其中感觉运动训练强调运动期间结合触觉、听觉、视觉、肌肉张力等感觉刺激，可调节肢体运动能力、整体协调性[4]。但部分KOA患者单纯行感觉运动训练治疗恢复慢，整体疗效欠佳。中医治疗KOA多以外治法为主，其中针灸可促进软骨炎性物质吸收，改善软骨代谢水平，抑制炎性细胞因子水平，缓解关节软骨病变[5]。近年来，针灸联合感觉运动训练治疗KOA的研究较多见，且临床疗效良好，但其具体作用机制尚未阐明。Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)/核因子-κB(Nuclear Factor κB，NF-κB)炎性信号通路是一种典型的炎症反应调节信号。此炎性轴激活可导致机体成骨细胞出现异常增殖、分化，影响膝关节内软骨增殖、炎性状态，在KOA发生、发展中起促进作用[6]。故本研究基于TLR4/NF-κB 炎性轴探讨针灸与感觉运动训练联合对KOA模型大鼠运动能力的影响，为KOA治疗及预后评估提供新思路。

1 材料

1.1 动物50只清洁级健康雄性SD大鼠(中国疾病预防控制中心，许可证号：SYXK(京)2019-0050)，8～10周龄，体质量200～250 g，标准饮食，自由饮水，每日光照及黑暗时间各12 h，温度19～26 ℃，相对湿度40%。本研究经实验动物伦理委员会审核批准，伦理批号：JZHPLA2019042002。

1.2 试剂戊巴比妥钠(美国Epitomics公司，批号：150214)；白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶联免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司，批号：190522、190307)；Trizol法试剂盒(上海一基生物有限公司，货号：YIJI10254655)；兔抗大鼠TLR4、NF-κB一抗及山羊抗兔二抗IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：190106、180517、180326)；BCA蛋白试剂盒(湖北武汉富鑫远科技有限公司，批号：180527)；ECL化学发光试剂盒(上海科拉曼试剂有限公司，批号：190214)。

1.3 仪器紫外可见分光光计(北京普析通用仪器有限责任公司，型号：TU-1810)；光学显微镜(北京汗盟紫星仪器仪表有限公司，型号：MoticBA210)；实时荧光定量分析(Real-time fluorescence quantitative analysis，RT-PCR)系统(美国Thermo公司，型号：Applied Biosystems 7500)；无菌针灸针(固始公元医疗器械有限公司，型号：0.3 mm×25.0 mm)；艾柱(规格：长度15 mm，直径12 mm，上海泰成科技发展有限公司，型号：AJ-L1)。

2 方法

2.1 模型制备及分组50只大鼠中随机取10只作为空白对照组，另40只大鼠采用向关节腔内注射碘乙酸钠的方法建立KOA大鼠模型[7]：用6.0%戊巴比妥钠(40 mg·kg-1)腹腔注射大鼠进行麻醉，自髌腱外侧身大鼠右膝关节腔注入磺乙酸钠(20 g·L-1)，每隔3 d注射1次，连续注射3次。完成注射后，标准饲养4周，完成造模。然后行病理组织检查，出现以下任3项或3项以上，即为造模成功：①大体观时关节软骨透明度较差，色泽灰暗；②大体观时关节内组织肿胀、充血或缺损；③镜下观时HE染色显示软骨基质染色变浅；④镜下观时存在软骨细胞增生。40只大鼠建模成功36只，成功率90.00%。36只大鼠经随机体质量排序法分为模型组、感觉运动训练组、针灸组、针灸联合感觉运动训练组，每组各9只。

2.2 药物干预建模2周后开始治疗。感觉运动训练组：建立感觉运动训练大鼠训练跑台，包括平面式跑道、左右摆动式跑道、前后摆动式跑道。各跑道跑带上粘贴不同摩擦系数材料，包括砂布、软毛，以供感觉运动训练需要。训练在上午800-1200进行，依次选择平面式跑道、左右摆动式跑道、前后摆动式跑道。训练时在跑道上粘贴砂布、软毛两种材料，按照Bedford等[8]研究选择中等运动强度，速度18 m·min-1，跑台坡度0°。各跑道分别运动 10 min，共30 min，每天1次，每周5 d，持续3周。运动期间，采用小木棒驱赶、声音刺激等方式，促使大鼠持续运动，且整个运动期间无电刺激。针灸组：每日下午1400进行，大鼠保持仰卧位，固定在解剖板上，以厚度适当的纱布垫在膝关节下，保持膝关节弯曲45°。按照钟秀会版《动物针灸学》[9]选择穴位，包括内膝眼穴、外膝眼穴、足三里穴。右手持无菌针灸针，垂直刺入，针柄处放置艾柱，点燃，每次 20 min，每天1次，持续3周。针灸联合感觉运动训练组每日上午进行感觉运动训练，下午进行针灸，方法和时间同上，每天1次，持续3周。空白对照组、模型组不给予任何处理。

2.3 大鼠运动能力检测分别在各组大鼠治疗3周后检测患侧肢体步态评分、后爪爪压，以评估运动能力。步态评分[10]：测试环境为3 m×3 m空旷场地，引导大鼠自由活动5 min，对其行走步态进行观察。步态正常，计0分；存在轻度跛行，受试肢体稍弯曲，计1分；存在中度跛行，受试肢体刚接触地面，计2分；存在重度跛行，受试肢体离开地面，其余三足着地行走，计3分。后爪爪压评分[11]：测试环境为25 cm×25 cm×20 cm透明玻璃室，将一镜子置于玻璃室下面，呈45°，引导大鼠自由活动5 min，经镜子观察其足部，评估右后爪爪压。两后爪下压力相等，计0分；脚掌压力稍下降，爪子完全接触地板，脚趾未张开，计1分；足底压力降低，足部稍弯曲，轻触地面，计2分；足部压力严重下降，足部抬起，计3分。

2.4 取材及处理完成运动能力测试后24 h，每组大鼠中随机取4只，以6.0%戊巴比妥钠(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，断头处死，取右膝关节软骨组织，以40 ng·L-1多聚甲醛固定，以备检测软骨组织病理学及关节软骨Mankin′s评分。另在每组剩余大鼠中随机取4只，以6.0%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，断头处死，取右膝关节软骨组织，分为3份，均置于液氮保存。

2.5 软骨组织病理学检测取40 ng·L-1多聚甲醛固定软骨组织，乙二胺四乙酸脱钙，石蜡包埋，切片，厚度4 μm。行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，经脱蜡、染核、分化、返蓝、染色、脱水、封片，在光学显微镜下对关节软骨细胞、基质等改变进行观察。

2.6 关节软骨Mankin′s评分按照1.2.5各组软骨组织病理检查结果，采用Mankin′s评分进行分级[12]：软骨正常，表层平整、光滑，HE染色均匀，计1分；软骨轻度损伤，表层稍欠平整，HE染色存在失染，计2～6分；软骨中度损伤，表层不平整，存在裂隙，深度达中层、深层，HE染色不均匀，计7～10分；软骨重度损伤，表面厚度变薄，裂隙深度达软骨下骨，HE染色全层存在明显失染，计11～14分。

2.7 ELISA法检测关节软骨IL-6、TNF-α水平取1份液氮保存关节软骨组织，以1 g10 mL比例添加无菌PBS液。冰上超声粉碎，震荡。4 ℃，12 000 r·min-1，离心20 min，离心半径10 cm，取上清液。按照试剂盒使用说明书对各组样品IL-1β、TNF-α水平进行测定。反应孔内置入标准品、稀释样品，密封，轻摇，37 ℃孵育 60 min。各孔洗涤，干燥，重复操作5次，AB显色液滴入，避光。37 ℃孵育10 min。完成显色后，终止液加入，反应时间为5 min，然后读取吸光度。以吸光度值为纵坐标，以标准液浓度为横坐标，创建浓度标准曲线，按照吸光度值获得样本浓度。

2.8 RT-PCR法检测关节软骨TLR4mRNA、NF-κBmRNA相对表达量取1份液氮保存关节软骨组织，添加4倍预冷生理盐水，制备成20%匀浆。总RNA采用Trizol法提取，检测各样本RNA浓度(g·L-1)，进一步逆转录获得互补链cDNA。逆转录条件：37 ℃,15 min；85 ℃,5 s，4 ℃终止。以1 μL cDNA作为模板，扩增TLR4、NF-κB，引物设计见表1。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s；60 ℃变性30 s，进行40个循环。9 ℃变性 15 s；60 ℃变性60 s；95 ℃变性15 s。以β-actin为内参，计算TLR4mRNA、NF-κBmRNA相对表达强度(2-△△CT)。

表1 RT-PCR引物序列

2.9 Western blot法检测关节软骨TLR4、NF-κB 蛋白相对表达量取1份液氮保存关节软骨组织，按照1 g10 L比例加入蛋白提取试剂，匀浆器研磨，超声波粉碎制备匀浆。4 ℃，12 000 r·min-1，离心15 min，离心半径10 cm，取上清液。蛋白浓度以BCA法检测，分别以30 μL样本加入各孔，按照目的蛋白相对分子量，实施十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳，蛋白质转膜。室温封闭，共1 h。加TLR4(11 000)、NF-κB(1500)、β-actin(12 000)一抗，4 ℃孵育，过夜。次日，洗涤后加入山羊抗兔二抗IgG室温下孵育1 h，洗膜。根据ECL化学发光试剂盒说明书，进行凝胶成像仪下显影、成像。经Image J软件(MAC版本)，测量条带灰度值。以目的蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值比值表示目的蛋白表达水平。

3 结果

3.1 各组大鼠步态评分、爪压评分比较与空白对照组比较，模型组大鼠步态评分、爪压评分显著升高(P<0.05)；与模型组比较，感觉运动训练组、针灸组、针灸联合感觉运动训练组大鼠步态评分、爪压评分显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠步态评分、爪压评分比较 分)

3.2 大鼠软骨组织病理学变化空白对照组大鼠软骨基质呈粉红色，着色均匀，软骨组织结构正常，浅表层、移行层、辐射层、钙化层结构清晰，软骨细胞排列整齐，潮线完整；模型组大鼠关节软骨组织结构层次模糊，软骨细胞排列散乱且数目少，潮线断裂，炎症细胞浸润明显；感觉运动训练组、针灸组、针灸联合感觉运动训练组大鼠软骨组织结构尚清晰，软骨细胞排列尚整齐且数目稍增多，潮线趋于完整，炎性细胞浸润减少，其中针灸联合感觉运动训练组改善最显著。见图1。

注：A：空白对照组；B：模型组；C：感觉运动训练组；D：针灸组；E：针灸联合感觉运动训练组

3.3 各组大鼠Mankin′s评分比较与空白对照组比较，模型组大鼠Mankin′s评分显著升高(P<0.05)；与模型组比较，感觉运动训练组、针灸组、针灸联合感觉运动训练组大鼠Mankin′s评分显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠Mankin′s评分比较 分)

3.4 各组大鼠关节软骨IL-6、TNF-α水平比较与空白对照组比较，模型组大鼠关节软骨IL-6、TNF-α水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，感觉运动训练组、针灸组、针灸联合感觉运动训练组大鼠关节软骨IL-6、TNF-α水平显著降低(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠关节软骨IL-6、TNF-α水平比较

3.5 大鼠关节软骨TLR4mRNA、NF-κBmRNA相对表达量比较与空白对照组比较，模型组大鼠关节软骨TLR4mRNA、NF-κBmRNA水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，感觉运动训练组、针灸组、针灸联合感觉运动训练组大鼠关节软骨TLR4mRNA、NF-κBmRNA水平显著降低(P<0.05)。见表5。

表5 各组大鼠关节软骨TLR4、NF-κB mRNA相对表达量比较

3.6 关节软骨TLR4、NF-κB 蛋白相对表达量与空白对照组比较，模型组大鼠关节软骨TLR4、NF-κB 蛋白相对表达显著上调(P<0.05)；与模型组比较，感觉运动训练组、针灸组、针灸联合感觉运动训练组大鼠关节软骨TLR4、NF-κB 蛋白相对表达显著下调(P<0.05)。见图2。

注：A：关节软骨TLR4、NF-κB 蛋白表达；B：关节软骨TLR4、NF-κB 蛋白相对表达量；与空白对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05

4 讨论

人体膝关节为承重关节之一，会因年龄增大、日常生活中活动量大等，出现KOA，引发膝关节疼痛、僵硬甚至畸形，严重影响患者活动，目前临床上尚无特效或治愈方法[13]。西医治疗多见药物止痛、氨基葡萄糖促膝关节软骨增殖、物理治疗、膝关节置换术等，但长时间应用可引发相关不良反应；手术创伤大，部分患者为老年人，对手术不耐受，术后恢复时间长，并发症多。而物理治疗更易被人们接受，其中运动训练被证实为KOA有效治疗方法之一[14]。康复训练中正常感官集成，在恢复平衡、改善运动能力中发挥重要作用[15]。感觉运动训练不仅具有运动训练功能，还能加强感觉训练，以改善动态平衡反应，逐渐成为KOA常用康复手段之一[16-17]。

中医学认为，KOA属于“骨弊”“痹症”“膝弊”等范畴，病因病机为脾胃虚弱，气血不足，肝肾阴虚，风寒湿火入侵，或跌打损伤，致经络不通，关节不利，不通则痛，治疗关键为调理脾胃，补肾益气，温经通络[18]。针灸为中医传统治疗手段之一，具有针刺、艾灸双重特点，艾灸温热作用可经针体向深部传导，发挥活血化瘀、通经活络等功效。研究发现，针灸在缓解骨关节疾病炎性损伤中有积极作用，但具体机制不明[19-20]。目前，中西医结合逐渐成为KOA治疗趋势，相关临床实践证实针灸与运动训练联用有一定价值，但尚未明确其作用机制[21]。本研究就该问题进行分析，重点探讨针灸与运动训练联用对大鼠运动能力的作用。

本研究在KOA大鼠针灸治疗时选用内膝眼穴、外膝眼穴、足三里穴，以疏通局部经络，促进关节内环境平衡恢复。内膝眼穴是骨痹治疗经验用穴，而外膝眼穴为辅助血海行气穴位，两者联用能对局部气血进行调整，且可通经活络；足三里穴为足阳明经合穴，经针灸可发挥调畅气血、调理脾胃、通经活络等作用。另外，《素问·痹论》中提出：“痛者，寒气多也”，说明寒气侵蚀参与了疼痛的发生。而针灸可温经散寒、通络止痛，故多被应用于治疗KOA。经由对上述穴位进行针灸，可起到消肿、消炎、止痛、改善关节活动度等作用。本研究所用感觉运动训练选择中等强度，可加快血液循环、新陈代谢，促进炎症吸收，且能促使关节滑液进入关节软骨，改善关节软骨营养、代谢活动，以保持关节活动能力。本研究结果发现，治疗后感觉运动训练组、针灸组、针灸联合感觉运动训练组步态评分、爪压评分均较模型组低，三组间呈下降趋势，这说明三种方法对KOA大鼠运动能力均有一定改善作用，而针灸感觉运动训练联合治疗时作用更显著。病理观察显示，与模型组比较，感觉运动训练组、针灸组、针灸联合感觉运动训练组大鼠软骨组织结构、软骨细胞、炎性细胞浸润程度均有所改善，其中针灸联合感觉运动训练组改善最显著，且感觉运动训练组、针灸组、针灸联合感觉运动训练组大鼠关节软骨Mankin′s评分较模型组低。上述结果提示，针灸联合感觉运动训练治疗不仅可改善KOA大鼠运动能力，还可减轻关节软骨病理损伤改变，修复软骨损伤。

本研究还分析了针灸联合感觉运动训练治疗改善KOA大鼠运动能力的机制。目前认为，KOA发生、发展中炎症反应发挥重要作用，KOA软骨细胞异常可促进分泌TNF-α等细胞炎症因子，这些因子被大量释放到细胞外基质，可影响基质细胞内代谢平衡，抑制软骨细胞生长，促使软骨细胞凋亡速度加快[22-23]。另外，TNF-α可经由对细胞产生刺激，促进合成分泌前列腺素E2，引发软骨损伤，其水平提升还可导致其他炎性因子如IL-6水平升高，加速破坏膝关节软骨[24-25]。本研究治疗后，与模型组比较，感觉运动训练组、针灸组、针灸联合感觉运动训练组关节软骨IL-6、TNF-α水平均降低，其中针灸联合感觉运动训练组下降最显著，这说明三种治疗方法均具有一定效果，但针灸联合感觉运动训练对炎症反应控制效果更理想，可减缓软骨细胞凋亡，修复关节软骨损伤。TLR4/NF-κB炎性信号通路是一种典型的炎症反应调节信号，其中TLR4活化能促使NF-κB表达量增加，诱发下游炎症因子转录调节，导致出现炎症反应，使得IL-6、TNF-α 等炎症因子水平异常升高[26-28]。研究发现，KOA发生、发展中，TLR4/NF-κB炎性信号轴激活发挥重要作用[29]。还有研究检测了KOA手术患者关节软骨，发现负重区软骨内TLR4mRNA、NF-κBmRNA 及蛋白相对表达量均上调，认为TLR4/NF-κB炎性轴介导的自身免疫炎症反应，可能在KOA发病机制中有一定作用[30]。本研究也发现，与空白对照组比较，模型组大鼠关节软骨TLR4mRNA、NF-κBmRNA及蛋白相对表达量均上调，这说明KOA大鼠存在TLR4/NF-κB炎性信号通路激活，这是导致IL-6、TNF-α等炎症因子释放，引发炎症反应的关键。而给予治疗后，感觉运动训练组、针灸组、针灸联合感觉运动训练组大鼠关节软骨TLR4、NF-κB蛋白相对表达量均较模型组下降，其中针灸联合感觉运动训练组下降最显著，说明针灸与感觉运动训练联合应用时可更好抑制TLR4、NF-κB 蛋白表达，这可能是联合治疗时大鼠运动能力改善的机制之一。因此，可通过针灸联合感觉运动训练治疗后KOA。本研究结果显示，针灸联合感觉运动训练干预3周，较各单一方法应用能更好提升KOA大鼠运动能力，改善关节软骨形态，降低IL-6、TNF-α水平，机制可能与抑制TLR4/NF-κB 炎症轴有关。

综上所述，联用针灸、感觉运动训练治疗可改善KOA大鼠运动能力，可能与抑制TLR4/NF-κB炎性轴表达有关。这为针灸联合感觉运动训练治疗KOA提供了更为客观、系统的理论依据，也为后期针灸联合运动疗法治疗KOA奠定基础。