病证结合动物模型研究进展*

胡齐帅，张晓艳

河南中医药大学，河南 郑州 450046

病证结合动物模型是指在中医药理论、现代医学理论与实验动物学知识的有机结合下，模拟出的与人类疾病表现和证候特征相同或相似的实验观察动物[1]。病证结合的理论最早见于《伤寒杂病论》[2]，当时的病证结合是中医辨病和辨证治疗的结合[3]。现代意义上的病证结合，是指现代医学辨病与中医辨证的结合，即先以现代医学理论明确疾病，再运用中医学概括患者当下的证型[4]。病证结合动物模型是这一理论思想的载体，希望借助现代医学和中医学的双重优势，从宏观与微观、不同层面多维地展现疾病的发生发展变化规律，对于探讨疾病病理生理变化与中医证候特征之间的关系具有极大的优势[5-6]，而且将时间观念引入模型，较好地体现出中医证的动态性与阶段性特征[7]。

1 造模思路的分类

病证结合动物模型必须反映疾病和证候的双重特征，而病与证是两种不同医学体系从不同的角度对疾病的解读，临床上同一患者，现代医学诊断为流行性感冒，中医辨证为风热犯肺，认识不同，但患者相同，病在证中，证在病中，病与证是一体的。因此，疾病动物模型也同样应该具有证候特征[8-9]，可以对疾病动物模型的证候属性进行归纳，从而确定为某一病证结合动物模型；证候动物模型也应该具有疾病特征，可以对证候动物模型进行疾病诊断，从而确定为某一病证结合动物模型。此外，还可采用疾病造模因素与证候造模因素相叠加的方法建立病证结合动物模型，也是目前最为常用的造模思路。

1.1 疾病动物模型辨证建模以疾病动物模型为基础，观察疾病在形成过程中证的变化过程及疾病模型形成后所属的中医证候[10]，然后确定为某一特定的病证结合模型。疾病动物模型根据制备过程中是否施加外在干预因素分为诱发性和自发性，由此建立的病证结合又可分为两类。

1.1.1 诱发性疾病动物模型辨证建模诱发性疾病动物模型是通过施加外在干预因素建立的。如梁建庆等[11]对新西兰大白兔采用体外电击诱发室颤动物模型，电击后发现模型动物呼吸微弱甚至停止(气短息促)，心室颤动(脉微细欲绝)，四肢肿胀，舌质淡苔白水滑，心电图异常及组织器官含水量增加，符合心阳暴脱证的病机和证候，成功构建心阳暴脱证心脏骤停动物模型。郎海燕等[12]对3批通过注射抗小鼠血小板血清建立的免疫性血小板减少症(ITP)模型相关数据进行了综合分析，发现小鼠除有明显的注射部位和皮肤自发性出血、外周血小板数值下降、凝血时间延长、骨髓产板巨核细胞减少等疾病特征外，还具有活动减少、不思饮食、大便溏稀、皮肤瘀斑、体质量减轻等表现，符合脾不统血证的辨识标准。王勇等[13]在中华小型猪冠状动脉前降支放置Ameroid缩窄环，制备出冠状动脉粥样硬化性心脏病慢性心肌缺血模型，术后从动物的一般状态、舌色、活动度、血液流变学、心电图、冠脉造影等方面进行证候评价，发现前4周表现为稳定的血瘀证[14]，8～12周则表现为气虚血瘀证。樊憬懿[15]先筛选出12周喂养能够诱导大鼠形成代谢综合征的配方饲料，参考中医临床脾气虚证、痰湿壅盛证的诊断标准，在喂养的第4周、8周、12周分别处死8只，采集信息进行证候评分，发现模型组大鼠4周出现脾气虚证、8周出现痰湿轻证、12周出现痰湿重证，很好地体现出疾病发展过程中证候的动态变化。

1.1.2 自发性疾病动物模型辨证建模自发性疾病动物是指实验动物未经任何有意识的人工处理，在自然情况下自发产生疾病，基因突变导致疾病，经定向培育而稳定遗传的实验动物[16]，如自发性糖尿病鼠、青光眼兔等。其制备方法主要通过自然繁殖，疾病的病理生理特征比诱发性模型更为稳定均一，而且在不同的发展阶段其中医证候特征也是稳定均一的，对自发性疾病动物模型进行辨证更易于建立理想的病证结合动物模型[8]。如自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)是国际公认的原发性高血压实验研究动物模型，屈会化等[17]对早期SHR(14～18周龄)进行了宏观表征及行为学的研究，发现基本符合高血压辨证分型中肝火上炎证的诊断。晚期的SHR(12月龄)则符合肝肾阴虚证的表现[18]。但是这种动物模型成本较高、技术复杂、饲养周期较长，在应用方面受到了限制[19]。

1.2 对证候动物模型进行疾病诊断[16，20]证候模型是利用动物的某些生物表征来模拟人体证候特征的一类动物模型。根据造模方法的不同分为中医病因模型、西医病理模型和病因病理复合模型。中医病因模型是根据中医理论认识建立的，如《黄帝内经》认为引发血瘀证的主要致病因素是寒邪和情志失调，采用夹尾激怒刺激法建立气滞血瘀动物模型[21]，冰水浴法建立寒凝血瘀动物模型[22]。这种模型在病因上更加符合中医逻辑思维，更容易被中医人士认同；在证的本质研究中，研究者发现某些证候与西医病因病理具有一定的关联，可以通过施加化学、物理、手术等因素模拟人类证候表现，这类证候模型称为西医病理模型。如甲状腺激素亢进所表现出的烦躁、消瘦、怕热、出汗等症状与阴虚表现相近，利用甲状腺素片造成实验动物甲状腺机能亢进模拟阴虚证候[23]。这种造模方法操作简单、可控性好、易于重复[24]，但在病因上存在与中医理论脱节的问题。上述两种造模方法相复合所建立的证候模型称为病因病理复合模型，如夹尾结合肾上腺素注射是较为理想的肝郁证造模方法[21]。

以证候动物模型为基础，对模型进行西医诊断，发现模型身上所具有的疾病，从而确定为某一病证结合。如赵迎盼等[25]采用新生母子分离+慢性束缚+番泻叶灌胃法模拟出肝郁脾虚证大鼠模型，大鼠内脏敏感性增高，疼痛阈值明显降低，出现腹泻等症状，与腹泻型肠易激综合征表现相符，从而建立肝郁脾虚型腹泻型肠易激综合征大鼠模型。目前，这种造模方法构建的模型很少，一方面受西医诊断的局限，对于某些证候模型，西医诊断不清或者无法明确诊断；另一方面由于不同的疾病有时会出现相同或相似的证候[26]，某些证候模型可能会诊断出多种疾病或者系统综合征，难以保证模型疾病的单一性和均一性。如气虚血瘀证是心脑血管疾病、消化系统疾病[27]、慢性肾病等疾病的常见证型，一证多病，涉及多个系统，对应多种疾病[28]。

1.3 疾病造模因素与证候造模因素相叠加将疾病造模因素与证候造模因素先后或同时施加于同一模型动物，从而建立病证结合动物模型。如陈剑磨等[29]先手术切除小鼠双侧卵巢模拟骨质疏松症，再注射氢化可的松1周模拟肾阳虚证，从而建立骨质疏松症肾阳虚小鼠模型。刘燕等[30]予大鼠腹腔注射抗原液致敏激发复制哮喘，根据“形寒饮冷则伤肺”的理论，给予0 ℃冰水混合物施以“饮冷”刺激，置于0 ℃恒温冰箱中进行冷冻施以“形寒”刺激，再进行水中力竭游泳使其劳累，从而建立哮喘病寒饮蕴肺证大鼠模型。李荣荣等[31]给予小鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇稀释液模拟肾阳虚证，然后滴鼻接种甲型流感病毒FM1从而建立肾阳虚小鼠外感模型。两种造模因素相复合能扩大病证结合的研究范围，满足以病统证下不同证型的研究。如在胶原诱导性关节炎模型上分别施加风寒湿刺激、风湿热刺激、高脂喂养等，可以分别建立类风湿关节炎多个不同证型的病证结合动物模型[32]。

1.4 讨论由疾病模型建立的病证结合，证候是对模型进行观察总结出的，病与证存在天然的内在联系，而且疾病模型的建立大多采用单一因素造模法，模型的可靠性和稳定性较好，但是证候的可控性差，不一定能够得到实验研究所需要的证型。由证候模型建立的病证结合，疾病是对证候模型进行诊断发现的，病与证也存在天然的内在联系，但是疾病的建立也存在可控性差的问题。疾病造模因素与证候造模因素相叠加的造模方法，能够充分考虑到疾病形成的中西医病因，造模因素更加全面。而且能够分别或同时模拟实验研究所需要的疾病和证候，相比单一因素造模法，模型的成功率更高。但是两种造模因素相叠加的造模过程中，施加的外在干预因素较多，可能会割裂病与证的内在联系[9，33]。有学者认为这种造模方法建立的病证结合，在方药反证的评价过程中，疾病相关的指标变化尤为重要，中医重在辨证论治，同病异治和异病同治都在说明中医治疗通过改变证候从而扭转疾病的发展方向，如果使用与证相对应的方剂进行治疗，疾病指标能够大幅度改善，就能够证明证与病存在关联性[9]。其次，这种造模方法不能是简单的“1+1”模式，如在流感病毒感染模型的基础上叠加情志刺激，模型虽有肝郁证的表现，但可能只是模型的兼证，不足以概括模型的证候属性。应该通过临床调查研究，选择关联性较强的疾病和证候来建立病证结合，如风热证是流感最为多见的证型[34]，流感病毒也多被认为属于风热疫毒[35]，因而风热环境刺激+流感病毒感染更易于成功构建流感风热证动物模型。

表1 各种造模思路的优势与不足

2 模型的评价

模型的评价分为两部分，疾病的诊断依据实验室指标，比较客观成熟，证候评价还处于发展阶段，目前主要从以下四个方面进行评价。

2.1 造模因素评价源自中医的审因论治，通过分析感邪的性质和途径来推断证候属性。如大黄苦寒泻下，灌服大黄煎剂所诱导的模型证候属性为脾胃虚寒证，但也有可能是脾肾阳虚证。中医病因致病具有多重性和非特异性，一种证候可由多种不同病因引起，同样的致病因素亦可能出现不同的证候，而且多因素造模所建立的模型，造模因素之间又相互影响，使用现代医学手段建立的模型在病因上也很难用中医理论对其解释，这些问题极大地增加了造模因素评价的难度和不可靠性，因此在实际应用中大多作为参考。

2.2 四诊信息评价中医辨证是对四诊信息的采集与归纳，以四诊信息为着眼点建立和评价模型证候，较接近临床实际[36]。但在实验研究中，人为观察和描述主观性太强，没有客观证据，容易受到质疑。为了实现四诊信息的客观化采集和定量分析，很多学者都在努力探讨新的技术和方法。如用舌面图像饱和度(R，G，B)值分析舌面色泽变化[37]。借助动物行为学实验如旷场实验、明暗箱实验、糖水偏好实验等评价模型动物的运动功能、精神状态[38-39]。采用证候评价量表的方法对四诊信息进行量化分析[40]。杜正彩等利用发光二极管环形冷光源、数码摄像与计算机图像处理等现代科技成果，成功开发了中医实验动物证候表征采集分析系统，可实现对实验动物整体毛色、舌色、眼睛、耳廓、足爪、尾巴等与望诊相关的动物表征指标的在线采集分析[41]。赵慧辉等[42]提出采用临床证候诊断标准的等效对应进行动物模型证候属性的判定。如用游泳力竭时间缩短反映大鼠神疲乏力，呼吸频率加快反映大鼠喘促，心电图描记到心律失常可以部分反映心悸或结、代等脉象。目前，四诊信息的客观化仍处于探索阶段，一些关键性的主观特征尚未找到可匹配采集的指标，舌苔和脉象还难以实现客观、定量地采集[43]。

2.3 生化指标评价将与证候相关的生化指标纳入证候诊断指标，如脾虚胃肠道消化吸收功能减退，D-木糖排泄率作为反映肠道功能的指标，可用来反映脾虚的程度[44]。证是基于中医思维而提出的，是对一组具有内在联系的症状群的概括，往往涉及多个器官、系统的功能紊乱或损伤，基于中医证候的复杂性，现代医学从多个角度、多个学科对其展开研究，如肾阳虚相关研究指标涉及下丘脑-垂体-靶腺轴、免疫系统、肾功能、能量代谢、自由基代谢等[45]，但是这些指标大多只反映证的某一方面，如性腺轴指标主要反映肾阳虚生殖功能变化[46]，免疫学指标主要反映肾阳虚抗邪能力的变化。在病证结合模型的评价中，应该根据具体疾病优先选择相关评价指标，如肾阳虚外感病模型，其指标评价重点要放到免疫学方面。中医药理论始终强调整体观，单一指标并不能很好的体现证候的整体性和动态性，不同的生化指标组合变化模式也许能更好地体现证候的属性特点[47]。

2.4 方药反证方药反证是基于方证相应的理论推测模型的证候属性。如用益气滋阴的代表方剂黄芪汤治疗辐射损伤大鼠，大鼠临床症状及客观指标明显改善，由此反推辐射损伤大鼠模型属气阴两虚证[48]。但是目前大多只选出一组方药对动物所属证型作结论性判断，缺乏阴性对照和阳性对照，难以保证这组方药在认定模型证候属性方面具有排他性或特异性[49]。而且方药又具有多靶点、多效应的特点，模型的证候判定不能只依赖药物反证这一种方法，还需综合动物表征、相关指标进行评价。

3 总结

病证结合动物模型的构建要尽可能地与临床相同或相近，相关的研究结果才具有临床价值。任何疾病的形成都不是单一因素作用的结果，采用疾病造模因素与证候造模因素相叠加的造模方法，能兼顾到疾病形成的中西医病因，考虑到环境、情志、饮食、劳倦、体质等因素对疾病形成的影响[50]，造模因素更加全面，也使模型更加贴近临床实际，而且模型成功率较高，容易得到实验研究所需要的疾病和证候，要通过临床调查研究，选择关联性较强的疾病和证候建立病证结合，同时也要注意动物的体质因素及疾病所处的阶段都会对证候的形成造成影响[51]。证候的评价体系需要不断地完善，证的本质研究尚未取得突破，模型的评价依然要以动物的表征为主，努力探索四诊信息客观化采集与评价的技术方法，以保证模型的稳定性和可靠性，再进一步探讨证候的生物学物质基础。技术的进步带动行业的发展，证候的研究要结合最新的科学技术，结合现代医学的理论和方法，综合多学科知识，在基因组、蛋白质组和代谢组等各个层面开展研究，才能不断地推进中医药的现代化发展。