大蒜素对大鼠深Ⅱ度烧伤创面微循环的改善作用*

凌书建，杨丽萍，陶剑光，王小飞，苏晓利，王杰

邯郸市中心医院，河北 邯郸 056000

烧伤具有较高的致死率和致残率，并且烧伤发病率高居外伤疾病谱第四位[1]。皮肤是最易受烧伤损害的体表组织，皮肤创面愈合是烧伤治疗的关键，而烧伤后局部血液瘀滞、微血栓形成将导致创面组织进行性坏死，从而增加治疗难度并影响预后。因此，及时改善创面微循环以挽救濒死细胞对提高烧伤治疗预后意义重大[2-4]。大蒜素是天然存在的一种二烯丙基三硫化物，具有抑制血小板聚集、扩张血管等药理学作用[5-7]，但大蒜素对烧伤创面组织微循环的影响尚未见文献报道。本实验探讨大蒜素对烧伤创面微循环的影响。

1 材料

1.1 动物清洁级雄性Wistar大鼠150只，7周龄，体质量210～240 g，购自河北省实验动物中心提供[许可证号：SCXK(冀)2018-004]；适应性饲养1周后开展实验[饲养环境：光照/黑暗12 h/12 h，温度(25±1)℃]，实验过程严格按照我院伦理委员会批准的实验方案进行,伦理批号：HDZXLL(K)字2020-007。

1.2 药物与试剂大蒜素注射液(徐州莱恩药业有限公司，规格：2 mL：30 mg，批号：20190224)；乳酸钠林格注射液(石家庄四药有限公司，批号：20191207)；可溶性血管细胞黏附分子1(soluble vascular cell adhesion molecule-1,sVCAM-1)、血管紧张素-Ⅱ(angiotensin-Ⅱ,Ang-Ⅱ)、一氧化氮(nitric oxide,NO)检测试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司，批号：20190114、20190307、20190326)；兔抗鼠内皮素1(endothelin-1,ET-1)、一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)、β-actin单克隆抗体(上海碧云天生物技术有限公司，批号：20181223、20181130、20190118)；ECL超敏化学发光液(美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：EB190217)；40 ng·L-1多聚甲醛、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)(天津科密欧化学试剂有限公司，批号：201911016、201904013)。

1.3 仪器YLS-5Q型烫伤仪(天津科技发展有限公司)；CUT4050型石蜡切片机(德国Leica公司)；LISCA型激光多普勒血液灌流成像仪(瑞典Perimed公司)；Allegra 21R型低温离心机(美国Beckman公司)；LBY-NJ型血小板聚集仪(北京普利生有限公司)；Tetra Systerm型电泳槽(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 模型制备与给药①深Ⅱ度烧伤大鼠模型的制备[8]：实验前动物禁食禁水12 h，麻醉后剔除背部毛发并用硫化钠溶液(8%)脱毛、75%乙醇消毒，假烧伤组大鼠立即腹腔注射给予5 mL乳酸钠林格溶液以抗休克处理；其余各组通过烫伤仪(设置压力0.03 MPa、温度106 ℃、时间5 s)制备大鼠模型，通过病理学检查判断造模结局成功(见图1，大部分真皮层内细胞坏死，部分毛囊等附件残存)，立即腹腔注射5 mL乳酸钠林格溶液。②给药：将模型制备成功的大鼠，随机分为模型组、大蒜注射液低、中、高剂量组(5 mg·kg-1、10 mg·kg-1、20 mg·kg-1)，每组30只，各组给予相应药物，假烧伤组和模型组给予同体积生理盐水，疗程14 d。

注：A：假烧伤组；B：模型组

2.2 创面情况肉眼观察及组织病理学检查①治疗完成后，通过肉眼观察创面情况，包括结痂状况、分泌物、愈合状况等方面变化；②各组随机取10只大鼠并颈椎脱臼致死，取创面皮肤组织置40 ng·L-1多聚甲醛溶液72 h实施固定，经梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片(厚度5 μm)、展片后行HE染色，然后梯度酒精脱蜡、二甲苯透明后封片，通过倒置光学显微镜观察组织病理学改变。

2.3 创面愈合率的计算各组随机取10只大鼠，于给药前和给药第14天后对皮肤烧伤创面进行拍照，然后计算创面面积。

创面愈合率(%)=(1-未愈创面面积/初始创面面积)×100%

2.4 创面组织微循环血流灌注值(microcirculation perfusion valued,MPD)和含水量的测定[9]①通过激光多普勒血液灌流成像仪测定创面组织MPD值，室温25 ℃，仪器参数设置：扫描速度100 ms/Line、扫描宽度64像素、轮廓50像素、视距12 cm、显示频率5 Hz，各扫描5次取平均值。②各大鼠经颈椎脱臼致死，取创面组织称其质量(W1)，置95 ℃烤箱烘烤至恒重后称质量(W2)。

创面组织含水量(%)=(W1-W2)/W1×100%

2.5 血小板聚集率的测定取各组剩余10只大鼠，麻醉后，通过枸橼酸钠抗凝管经腹主动脉取全血，制备含血小板血浆和贫血小板血浆，调整其浓度为1.5×108mL-1，以ADP做为血小板聚集诱导剂，通过血小板聚集仪测定各组大鼠ADP诱导6 min时的血小板聚集率[10]。

2.6 血清sVCAM-1、Ang-Ⅱ、NO含量测定经腹主动脉取血(不抗凝)，离心取血清，然后按照ELISA试剂盒操作说明测定各组大鼠血清sVCAM-1、Ang-Ⅱ含量，并采用硝酸还原酶法测定血清NO含量。

2.7 创面组织ET-1、NOS蛋白表达的测定将大鼠均颈椎脱臼致死后取创面皮肤组织，剪碎、加入9倍量4 ℃冷裂解液行研磨匀浆，低温4 ℃离心(参数设置：12 000 rpm、15 min)取上清，BCA法测定总蛋白含量后，依次行凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h，滴加ET-1、NOS、β-actin单抗后 4 ℃ 孵育12 h，洗膜后滴加山羊抗兔IgG二抗，37 ℃ 振荡孵育1 h，PBS洗膜后滴加ECL显色发光，运用凝胶成像系统获得条带灰度值；以β-actin为内参，以条带灰度值半定量ET-1、NOS蛋白表达量。

3 结果

3.1 各组大鼠烧伤创面情况一般情况假烧伤组大鼠创面皮肤正常、毛发长度已基本恢复；模型组大鼠皮肤创面坏死组织基本脱落，但新生肉芽较少、结痂厚度不均匀，仍有少量黄色液体渗出，毛发缺失；大蒜素低、中、高剂量组大鼠皮肤创面不同程度缩小，无渗出液，毛发开始生长，其中大蒜素高剂量组创面大部分结痂脱落、新愈合皮肤红润且弹性良好、毛发生长较为旺盛，其效果最为显著。

3.2 各组大鼠烧伤创面组织病理学变化结果假烧伤组大鼠创面组织未见明显异常；模型组大鼠创面组织可见真皮下层组织水肿，胶原纤维肿胀、断裂炎性细胞浸润等明显的病理学形态结构改变；大蒜素低、中、高剂量组大鼠创面组织可见白色皮粒形成、上皮组织排列整齐，汗腺和皮脂腺结构完整、排列整齐但仍较表浅，炎性细胞浸润明显好转；其中大蒜素高剂量组效果更为显著。见图2。

注：A：假烧伤组；B：模型组；C：大蒜素低剂量组；D：大蒜素中剂量组；E：大蒜素高剂量组

3.3 各组大鼠烧伤创面愈合率比较与模型组比较，大蒜素低、中、高剂量组大鼠创面愈合率显著升高(P<0.05；P<0.01)。见表1。

3.4 各组大鼠烧伤创面MPD和含水量比较与假烧伤组比较，模型组大鼠创面MPD显著降低、含水量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，大蒜素中、高剂量组MPD显著升高且含水量显著降低(P<0.05；P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠烧伤创面愈合率、MPD和含水量比较

3.5 各组大鼠血小板聚集率比较与假烧伤组比较，模型组大鼠血小板聚集率显著升高(P<0.01)；与模型组比较，大蒜素中、高剂量组大鼠血小板聚集率显著降低(P<0.05；P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠血小板聚集率

3.6 各组大鼠血清sVCAM-1、Ang-Ⅱ、NO含量比较与假烧伤组比较，模型组大鼠血清sVCAM-1、Ang-Ⅱ、NO含量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，大蒜素中、高剂量组sVCAM-1、Ang-Ⅱ、NO含量显著降低(P<0.05；P<0.01)。见表3。

表3 各组大鼠血清sVCAM-1、Ang-Ⅱ、NO含量

3.7 各组大鼠烧伤创面组织ET-1、NOS蛋白表达比较与假烧伤组比较，模型组大鼠烧伤创面组织ET-1、NOS蛋白表达量显著上调(P<0.05；P<0.01)；与模型组比较，大蒜素中、高剂量组ET-1表达量显著下调而NOS蛋白表达量显著上调(P<0.01)。见图3、表4。

注：A：假烧伤组；B：模型组；C：大蒜素低剂量组；D：大蒜素中剂量组；E：大蒜素高剂量组

表4 各组大鼠烧伤创面组织ET-1、NOS蛋白表达量

4 讨论

微循环障碍是烧伤所致的重要病理生理学改变，是导致烧伤创面加重而影响治疗预后的重要因素，通过药物改善微循环能够明显促进烧伤创面愈合[11-13]。研究发现，大蒜素能够通过扩张血管、抑制血小板聚集等而促进血液循环[14-15]。临床上以深Ⅱ度烧伤最为常见，本实验制备深Ⅱ度烧伤大鼠模型并给予大蒜素进行治疗。

血小板聚集是血小板的主要生理功能，黏附聚集于血管内皮表面而缩窄血管腔，从而影响微循环，甚至血小板聚集是病理性血栓形成的核心环节[16-19]。血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)是介导血管内皮细胞黏附进而诱导血栓形成的重要分子。研究发现，生理状态下VCAM-1表达量较低，而在病理刺激下其表达上调，血清sVCAM-1含量与血管内皮细胞VCAM-1表达正相关[20-21]。研究发现，丙泊酚可降低改善烧伤大鼠血液血小板聚集的高凝状态，改善烧伤创面微循环[22]；研究发现，芹菜素可改善大鼠烧伤创面微循环，有效促进创面愈合[23]。本研究结果显示，经大蒜素治疗能够显著降低深Ⅱ度烧伤大鼠血小板聚集并抑制内皮细胞黏附，这可能是大蒜素改善深Ⅱ度烧伤大鼠皮肤创面局部微循环、促进创面愈合的重要机制。

血管扩张则有助于改善微循环。NO是内皮细胞中L-精氨酸在NOS催化作用下产生的，具有血管扩张的生理作用[24]。研究发现，Ang-Ⅱ是一种多功能活性肽，通过作用于血管平滑肌上的血管紧张素受体表现出较强的缩血管作用[25]。ET-1是体内另一种强效血管收缩肽且在病理状态下能够促进Ang-Ⅱ分泌[26-28]。研究发现，降低Ang-Ⅱ能够有效改善烧伤创面微循环，进而促进创面愈合[29]。本研究结果显示，经大蒜素治疗能够显著降低深Ⅱ度烧伤大鼠血清NO、Ang-Ⅱ含量，上调烧伤创面组织NOS表达并下调ET-1表达，提示大蒜素具有促进创面血管扩张的作用，可能是大蒜素改善深Ⅱ度烧伤大鼠皮肤创面局部微循环的另一机制。

综上所述，大蒜素能够通过改善局部微循环而促进大鼠深Ⅱ度烧伤创面愈合，其机制可能与降低血小板聚集、抑制内皮细胞黏附、促进血管扩张有关。提示大蒜素能够改善深Ⅱ度烧伤大鼠皮肤创面局部微循环并促进烧伤创面愈合。