牛蒡子苷元调控CTRP6对七氟烷麻醉后大鼠炎症反应和认知功能障碍的影响*

王鹏程，杨扬，崔明珠，李治松

1.黄淮学院直属附属驻马店市中心医院，河南 驻马店 463000； 2.河南省人民医院，河南 郑州 450003； 3.郑州大学第二附属医院，河南 郑州 450014

麻醉是现代医学诊疗过程中重要的辅助手段，但全身麻醉可能会对机体产生不良的影响，甚至诱发神经毒性[1]。既往研究证实，麻醉引发的神经毒性与氧化应激、神经性炎症及神经元凋亡等密切相关，但其具体作用机制尚不清楚[2-4]。七氟烷是目前临床上使用较为广泛的吸入性麻醉剂，长时间及过量的七氟烷吸入会严重损害神经系统功能，包括神经系统发育、空间学习记忆能力等[5-7]。海马作为大脑中枢神经系统中最为复杂的部位，其损伤时会引起学习减退、记忆能力降低及认知功能障碍等[8-9]。既往研究显示，七氟烷能够通过促进炎性因子表达，诱导海马神经元凋亡，导致大鼠认知功能障碍[10]。但是，有关七氟烷对海马神经损伤的调控机制尚不完全清楚，因此，探寻七氟烷对认知功能障碍的机制并予以干预治疗尤为重要。

中医药干预治疗对于改善大鼠麻醉后炎症反应和认知功能障碍具有重要作用。2020年版《中华人民共和国药典》记载牛蒡子具有疏散风热、宣肺透疹、解毒利咽的功效，治疗感冒发热、痈肿化脓、丹毒痄腮等疾病效果显著。新近研究发现，牛蒡子具有抗炎和改善学习记忆等作用[11]。牛蒡子苷元是从中药牛蒡子中提取得到的木脂类化合物，具有抗炎、抗氧化及神经保护等作用[12]。研究表明，牛蒡子苷元能够通过磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)信号通路改善阿尔茨海默病小鼠学习和记忆能力障碍[13]。在弓形虫诱导的BALB/c小鼠神经精神疾病模型中，牛蒡子苷元能够通过Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)/核转录因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)信号通路减轻小鼠神经性炎症[14]。C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白6(C1q/tumor necrosis factor-related protein 6，CTRP6)是与炎症反应密切相关的一类脂肪因子蛋白超家族成员。研究发现，CTRP6能够通过调节Akt/NF-κB信号通路影响高糖诱导的肾小管间质细胞炎性反应[15]。因此，本研究旨在探究牛蒡子苷元能否通过调节CTRP6/Akt/NF-κB信号通路改善七氟烷诱导的大鼠神经性炎症及认知功能障碍，为七氟烷不良反应的预防提供实验依据。

1 材料

1.1 动物雄性SPF级6周龄SD大鼠50只，体质量200～220 g，购于郑州大学实验动物中心，许可证号：SYXK(豫)2019-0025。动物饲养在SPF级饲养室内，昼夜12 h/12 h交替，室内温度(25±2) ℃，期间自由饮食，饮水。动物实验经过驻马店中心医院动物伦理委员会审核批准，伦理批号：202002003。

1.2 药品与试剂七氟烷(山东鲁南贝特制药有限公司，批号：65170507)；牛蒡子苷元(武汉科斯坦生物科技有限公司，纯度≥98%，批号：HB-01110)。二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，济南世纪通达化工有限公司，批号：CAS67-68-5)；白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(美国Sigma公司，批号：RAB0311、RAB0277、RAB0479)；苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色试剂盒、原位缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidy transferase mediated nick end labeling，TUNEL)凋亡检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、羊抗兔IgG抗体、羊抗鼠IgG抗体、β-actin抗体(上海碧云天生物技术有限公司，批号：C0105S、C1088、P0009、A0239、A0192、AF5001)；CTRP6抗体、Akt抗体、p-Akt抗体、NF-κB抗体、p-NF-κB抗体(英国Abcam公司，批号：ab36898、ab8805、ab38449、ab32536、ab76302)；CTRP6免疫组织化学检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术公司，批号：SP-9001)。

1.3 仪器TWK-FST32型组织匀浆仪(武汉泰普拓科技有限公司)；Micro17R型高速冷冻离心机(离心半径：20 cm)、FC型全自动多功能酶标检测仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；GPJ9-TS100-F型倒置荧光显微镜(日本Nikon公司)；1658033型电泳仪、ChemiDoc XRS+成像系统(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 药物制备称取适量牛蒡子苷元，采用 200 μL DMSO进行溶解，使其终浓度分别为1 g·mL-1和0.05 g·mL-1，4 ℃条件下保存备用。

2.2 大鼠分组、造模及干预50只雄性SPF级SD大鼠按照随机数字表法分为对照组、七氟烷组及牛蒡子苷元低(5 mg·kg-1)、中(10 mg·kg-1)、高(20 mg·kg-1)剂量组，每组10只。除对照组外，其余组大鼠进行6%七氟烷吸入性麻醉，3 h后自然苏醒，对照组大鼠不做任何处理。牛蒡子苷元低、中、高剂量组大鼠在七氟烷吸入麻醉前腹腔注射 200 μL 牛蒡子苷元溶液，对照组和模型组大鼠给予等体积DMSO。给药48 h后进行相关指标的检测。

2.3 Morris水迷宫实验定位航行实验：5组大鼠连续训练3 d，训练时，将大鼠从面向池壁的4个入水点放入水中，记录大鼠从入水到明确找到并站立于水下隐蔽平台的时间，即为逃避潜伏期。每只大鼠从池壁的4个入水点分别训练1次，每次间隔时长30 s。训练结束后，每组随机选取6只大鼠进行实验。空间探索行为实验：在定位航行实验结束后，撤去平台，大鼠从池壁的同一入水点放入水中，记录大鼠在60 s内穿越原平台的次数，即为穿台指数。

2.4 ELISA法检测大鼠血清炎症因子水平大鼠麻醉后，心脏取血，4 ℃，3 000 r·min-1离心 10 min，取其上清，按照ELISA检测试剂盒说明书操作，检测大鼠血清炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的含量。

2.5 HE染色观察大鼠海马组织病理形态各组大鼠麻醉后，迅速断头取脑，每组随机取6只大鼠脑组织，摘取视交叉至漏斗柄的脑片，采用4%多聚甲醛固定各组大鼠海马组织，脱水、透化、包埋、石蜡切片，并按照HE染色试剂盒进行海马组织染色，显微镜下观察各组大鼠海马组织形态学变化。

2.6 TUNEL染色观察海马神经元凋亡按“2.5项”下操作制备石蜡切片，按照TUNEL法测定大脑海马神经元凋亡。其中，细胞核呈荧光绿色的细胞为TUNEL阳性细胞，即凋亡细胞。

细胞凋亡率(%)=TUNEL阳性细胞数目/细胞总数目×100%

2.7 免疫组化检测大鼠海马组织CTRP6的表达每组取6只大鼠，采用4%多聚甲醛固定大鼠海马组织，脱水、透化、包埋、石蜡切片，组织切片厚度为3～5 μm，采用3%H2O2溶液孵育10 min消除内源性过氧化物酶，85 ℃抗原修复，加入10%BSA溶液封闭20 min。加入CTRP6抗体(1:200)，4 ℃条件下孵育过夜。加入对应羊抗兔IgG抗体(1:2 000)，室温条件下孵育30 min。滴加DAB显色液，利用Image Pro Plus软件进行图像分析，评估CTRP6蛋白的表达水平。

2.8 Western Blot检测海马组织CTRP6、Akt、p-Akt、NF-κB及p-NF-κB蛋白表达水平取大鼠海马组织进行研磨，裂解。BCA法测定蛋白质浓度，凝胶电泳，湿转法转膜。5%脱脂牛奶室温封闭2 h，分别加Akt抗体(1:1 000)、p-Akt抗体(1:1 000)、NF-κB抗体(1:1 000)、p-NF-κB(1:1 000)抗体、CTRP6抗体(1:500)及β-actin抗体(1:2 000)，4 ℃孵育过夜。加对应的羊抗兔IgG抗体(1:5 000)或羊抗鼠IgG抗体(1:5 000)，孵育1～2 h。加含吐温-20的磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，每次5 min，加入显影液，显影并拍照。以目的蛋白条带灰度值与β-actin灰度值的比值反映目的蛋白的相对表达量。

3 结果

3.1 牛蒡子苷元对大鼠学习记忆能力的影响与对照组比较，七氟烷组大鼠逃避潜伏期时间显著延长(P<0.05)，穿台指数显著降低(P<0.05)；与七氟烷组比较，牛蒡子苷元低、中、高剂量组大鼠逃避潜伏期时间显著缩短(P<0.05)，穿台指数显著增加(P<0.05)。见图1。

注：A：逃避潜伏期；B：穿台指数；与对照组比较，#P<0.05；与七氟烷组比较，*P<0.05

3.2 牛蒡子苷元对大鼠血清炎症因子含量的影响与对照组比较，七氟烷组大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量显著升高(P<0.05)；与七氟烷组比较，牛蒡子苷元低、中、高剂量组大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 牛蒡子苷元对大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量的影响

3.3 牛蒡子苷元对大鼠海马组织形态学的影响对照组大鼠海马CA1区神经元结构完整、清晰，细胞呈极性排列；七氟烷组大鼠海马CA1区神经元数量显著减少，细胞排列紊乱，细胞大部分皱缩，部分神经元细胞核固缩、染色质出现明显聚集；牛蒡子苷元各剂量组大鼠海马CA1区病理性损伤明显减轻。见图2。

图2 牛蒡子苷元对大鼠海马组织病理变化的影响(HE，×200)

3.4 牛蒡子苷元对大鼠海马神经元凋亡的影响与对照组比较，七氟烷组大鼠海马CA1区神经元凋亡指数显著升高(P<0.05)；与七氟烷组比较，牛蒡子苷元各剂量组大鼠海马CA1区神经元凋亡指数均显著降低(P<0.05)。见图3、图4。

图3 牛蒡子苷元对大鼠海马神经元凋亡的影响(TUNEL染色)

注：与对照组比较，#P<0.05；与七氟烷组比较，*P<0.05

3.5 牛蒡子苷元对大鼠海马组织CTRP6表达的影响与对照组比较，七氟烷组大鼠海马组织CTRP6表达显著降低(P<0.05)；与七氟烷组比较，牛蒡子苷元各剂量组大鼠海马组织CTRP6表达均显著增加(P<0.05)。见图5。

注：A：免疫组化染色结果；B：Western Blot检测结果；与对照组比较，#P<0.05；与七氟烷组比较，*P<0.05

3.6 牛蒡子苷元对Akt/NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响与对照组比较，七氟烷组大鼠海马组织p-Akt/Akt和p-NF-κB/NF-κB的水平显著增加(P<0.05)；与七氟烷组比较，牛蒡子苷元组大鼠海马组织p-Akt/Akt和p-NF-κB/NF-κB的水平显著降低(P<0.05)。见图6。

注：与对照组比较，#P<0.05；与七氟烷组比较，*P<0.05

4 讨论

七氟烷吸入性麻醉与大脑记忆功能损伤密切相关，会诱发患者短暂性学习和记忆下降，其机制与抑制海马CA1区锥体神经元电压门控通道相关[16-17]。另外，七氟烷还可诱发海马组织氧化应激及炎性反应，从而促进神经元凋亡[18-19]。研究发现，海马神经过度炎症性反应及细胞凋亡是诱导认知功能障碍的重要机制。中医药治疗在改善海马神经损伤及认知功能障碍中发挥重要作用。既往研究发现，具有和表解里、疏肝升阳功效的苏郁胶囊能够抑制海马神经细胞凋亡[20]；具有健脾益智作用的定志小丸能够通过促进海马CA3区神经元细胞增殖，保护海马结构，从而改善慢性应激大鼠行为[21]。药食同源的牛蒡子始载于《名医别录》，味辛、苦，性寒，主要用于疏散风热、利咽消肿、疹出不畅、解毒透疹等症。牛蒡子含有多种成分，具有广泛的药理作用。研究发现，牛蒡子主要活性成分之一牛蒡子苷元广泛应用于神经系统性疾病的治疗，能够改善精神性疾病小鼠海马神经炎性反应及认知功能障碍[12]。本研究结果显示，七氟烷吸入性麻醉大鼠CA1区海马神经元数量显著减少，细胞排列紊乱，细胞大部分皱缩，部分神经元细胞核固缩、染色质明显聚集，学习功能减退、记忆能力下降，并伴有血清促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平的增加，海马神经元凋亡指数增加，进一步证实海马神经炎性反应及细胞凋亡与大鼠认知功能障碍密切相关。牛蒡子苷元干预后大鼠海马CA1区病理性损伤减轻，学习记忆功能明显好转，血清促炎因子 IL-6、IL-1β、TNF-α含量以及海马神经元凋亡指数降低，表明牛蒡子苷元能够通过抑制海马神经炎性和细胞凋亡改善七氟烷诱发的大鼠认知功能障碍。

Akt是一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，在细胞增殖、存活、葡萄糖代谢、凋亡以及血管生成等生物学功能中发挥重要作用[22-23]。研究表明，Akt广泛表达于机体各种组织，p-Akt是其活化形式[24-25]，能激活NF-κB，促进IκB与NF-κB解离，形成具有活性的p-NF-κB亚甲基，使其顺利进入细胞核，进而促进相关炎性细胞因子表达，最终导致炎性反应发生[26-27]。既往研究证实，七氟烷吸入性麻醉大鼠海马组织Akt磷酸化水平增加[28]。本研究结果显示，与对照组比较，七氟烷组大鼠海马组织p-Akt/Akt和p-NF-κB/NF-κB的水平显著升高；与七氟烷组比较，牛蒡子苷元组大鼠海马组织p-Akt/Akt和p-NF-κB/NF-κB的水平均显著降低，表明牛蒡子苷元可通过调控Akt/NF-κB信号通路抑制海马神经炎性反应和细胞凋亡，从而改善大鼠认知功能障碍。

CTRP6是脂肪因子蛋白超家族成员之一，广泛参与组织炎症及纤维化过程。既往研究表明，CTRP1、CTRP3及CTRP9与缺血性脑卒中患者神经功能损伤密切相关[29-31]。在脑出血小鼠脑神经损伤模型中，鼻腔内注射重组CTRP6能够通过脂联素受体1(adiponectin receptor 1，AdipoR1)/AMPK/NF-κB 通路抑制神经炎症反应，从而减轻脑水肿和神经功能[32]。本研究通过免疫组织化学和Western Blot检测显示，与对照组比较，七氟烷组大鼠海马组织CTRP6表达显著降低，提示CTRP6可能与海马神经炎性反应相关；牛蒡子苷元干预后，大鼠海马组织CTRP6表达显著升高，提示牛蒡子苷元可通过上调CTRP6的表达改善七氟烷诱发的大鼠神经功能损伤，进而改善七氟烷诱发的大鼠认知功能障碍。既往研究证实，敲低CTRP6能够抑制高糖诱导的肾小管间质细胞氧化应激、炎性反应及细胞外基质沉积，其机制与调控Akt/NF-κB信号通路相关[15]。

综上所述，牛蒡子苷元能够明显改善七氟烷麻醉诱发的大鼠神经性炎症反应和认知功能障碍，其作用可能与调控CTRP6/Akt/NF-κB信号通路有关。