氯化钴诱导缺氧环境对肝癌MHCC97-H细胞的影响

苏晓茹　　贵志芳　　柯强　　郑高明　　潘峰

[摘要] 目的 探讨CoCl2诱导缺氧环境对肝癌MHCC97-H细胞产生的影响，研究CoCl2处理下MHCC97-H细胞中相关蛋白质表达水平变化及细胞活力和细胞凋亡情况。方法 分别在对照组（21% O2）和实验组（20 μmol/L CoCl2）处理下培养MHCC97-H细胞，用Western-blot法检测细胞中蛋白质表达（HIF2α、G9a、Reptin），于0 h、6 h、24 h、48 h、72 h用CCK8法检测细胞增殖，于6 h、24 h时用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 与对照组相比，CoCl2处理的MHCC97-H细胞中HIF2α、G9a、Reptin蛋白质表达显著升高（P<0.05），细胞活力降低，72 h细胞活力显著低于对照组（P<0.05），24 h后细胞凋亡显著增加（P<0.05）。 结论 CoCl2处理可对肝癌MHCC97-H细胞产生明显影响，20 μmol/L CoCl2即可导致细胞内相关蛋白质表达水平显著变化，影响细胞的活力和凋亡。

[关键词] 氯化钴;肝癌MHCC97-H细胞;细胞活力;细胞凋亡

[中图分类号] R73          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2022）09-0026-04

Effect of cobalt chloride-induced hypoxic environment on hepatocarcinoma MHCC97-H cells

SU Xiaoru GUI Zhifang KE Qiang ZHENG Gaoming PAN Feng

Department of Laboratory Medicine， the Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University， Hangzhou   310015， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of CoCl2-induced hypoxic environment on the hepatocellular carcinoma MHCC97-H cells， and to study the changes of related protein expression levels， cell viability， and apoptosis in MHCC97-H cells treated with CoCl2. Methods MHCC97-H cells were cultured under the treatment of the control group （21% O2） and the experimental group （20 μmol/L CoCl2）. The protein expression （HIF2α， G9a， Reptin） in the cells was detected by the Western-blot method. Cell proliferation was detected by the CCK8 method at 0 h， 6 h， 24 h， 48 h， and 72 h. Cell apoptosis was detected by flow cytometry at 6 h， 24 h. Results Compared with the control group， HIF2α， G9a， and Reptin protein expression was significantly increased （P<0.05）， cell viability was decreased， cell viability was significantly lower （P<0.05） at 72 hours， and apoptosis was significantly increased （P<0.05） after 24 hours in CoCl2-treated MHCC97-H cells. Conclusion CoCl2 treatment can have a significant effect on hepatocarcinoma MHCC97-H cells. 20 μmol/L CoCl2 can cause significant changes in the expression of related proteins in the cells and affect cell viability and apoptosis.

[Key words] Cobalt chloride; Hepatocarcinoma MHCC97-H cell; Cell viability; Apoptosis

原發性肝癌是常见的消化系统恶性肿瘤，主要包括肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma， HCC）和肝内胆管癌两种组织学类型，其中HCC占肝脏恶性肿瘤的75%～85%，是我国较为常见的恶性肿瘤，发病率高、预后差，严重威胁人类的生命健康[1-3]。手术治疗仍为首选手段，但效果并不十分理想，术后5年复发率高达50%～70%[4]，如何降低HCC转移及术后复发一直是肿瘤领域的研究热点[5-6]。

缺氧是HCC最常见的微环境，与肿瘤的转移、浸润等均密切相关[7-9]。研究缺氧环境癌细胞的生长特性有助于了解转移、浸润的本质。用CoCl2诱导缺氧，适于快速建立稳定的体外细胞缺氧模型。而不同肿瘤细胞对CoCl2反应剂量可能不同[10-11]。目前关于肝癌MHCC97-H细胞对CoCl2反应剂量的报道较少。本研究旨在探讨CoCl2诱导缺氧对MHCC97-H细胞产生的影响，探讨细胞中相关蛋白质水平变化及细胞活力和细胞凋亡情况，为未来利用CoCl2构建MHCC97-H相关缺氧模型奠定基础。

1 材料与方法

1.1实验细胞和试剂

人肝癌细胞系MHCC97-H购于上海酶研生物科技有限公司（批号：CC-Y1613）。FBS（批号：E600001）、DMEM培养基（批号：E600003）、氯化钴（批号：A600316）、CCK-8试剂盒（批号：E606335）、Annexin V 凋亡检测试剂盒（批号：E606336）均来自BBI生命科学有限公司，HIF2α抗体（批号：ab207607）、G9a抗体（批号：ab185050）、Reptin抗体（批号：ab196027）均来自艾博抗（上海）贸易有限公司。

1.2 细胞培养

细胞用10% FBS加DMEM高糖培养基培养，置于37℃，5% CO2浓度培养箱中，生长到90%以上时传代。将对数生长期的细胞在96孔板中配置100 μL 2×104个/ml的细胞悬液。设对照组（21% O2）和实验组（20 μmol/L CoCl2），每组5个复孔。

1.3 Western blot检测

按实验分组培养细胞24 h，加100 μL裂解液使细胞裂解。取10 μL裂解物加入10 μL 2×SDS-PAGE loading buffer，100℃，5 min，冰上冷却3 min。室温12 000 g离心10 min去除不溶性沉淀，提取总蛋白并测定蛋白浓度。

用10% SDS-PAGE电泳分离样本。结束后，将PVDF膜在甲醇中浸泡1 min，用Transfer Buffer浸泡凝胶、滤纸和在甲醇中浸泡过的PVDF膜10 min，制备转移三明治。使用Semi-Dry Cell进行半干电泳转移。转移完毕，用1×Ponseau S solution染色并标记蛋白质条带位置。用Blocking Buffer封闭转印膜2 h。加入稀释一抗，4℃过夜。加入稀释的二抗，室温孵育2 h。用Super Signal West Pico Chemiluminent Substrates进行化学发光检测，对X线片曝光。经显影定影后，用凝胶成像分析系统拍照，用Gel-Pro Analyzer軟件分析。

1.4细胞活力检测

细胞预先培养24 h（37℃，5% CO2）。对照组（21% O2）加正常培养液，实验组加20 μmol/L CoCl2，将培养板在培养箱孵育一段时间（6 h、24 h、48 h、72 h）。按照试剂盒说明书，向每孔加10 μLCCK8溶液，在培养箱孵育1 h。用酶标仪测定450 nm处吸光度，计算细胞活力并绘制生长曲线。

1.5细胞凋亡检测

采用 PBS 洗细胞培养板两次，用胰酶消化，1000 rpm 离心5 min，弃去培养液，各管加10 ml PBS，轻柔地悬浮细胞，计数1×105细胞，放入100 μl 1× Binding Buffer，加入ANNEXIN V 5 μl孵育20 min，加PI 3 μl 孵育10 min，室温避光，加入400 μl Binding Buffer，流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

1.6 统计学处理

以上实验重复至少三次，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，使用Graphpad prism 6软件进行数据分析，用Bonferroni′s 多重比较检验分析方法（Bonferroni′s multiple comparisons test），P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验组与对照组MHCC97-H细胞形态观察

按照实验分组培养肝癌MHCC97-H细胞，24 h后，显微镜下观察：对照组MHCC97-H细胞贴壁良好，细胞的胞浆丰富，呈多边形，相邻细胞多紧密融合成片，而实验组培养基中漂浮细胞较多，细胞则变得相对稀疏，见图1。

2.2实验组与对照组MHCC97-H细胞相关蛋白质表达情况

按照实验分组培养肝癌MHCC97-H细胞，24 h后提取总蛋白，Westernblot方法检测细胞中HIF2α、G9a、Reptin表达，结果表明，与对照组相比，CoCl2处理的MHCC97-H细胞中HIF2α，G9a和Reptin蛋白表达均显著升高（P<0.05），尤其HIF2α表达量极显著，见图2～3）。

2.3实验组与对照组MHCC97-H细胞活力比较

按照实验分组培养肝癌MHCC97-H细胞，分别选取0 h、6 h、24 h、48 h、72 h检测细胞的吸光度，结果显示，与对照组相比，实验组MHCC97-H细胞活力降低，72 h细胞活力显著低于对照组（P<0.05），且随着时间延长，两组间差异逐渐增大，见图4。

2.4实验组与对照组MHCC97-H细胞凋亡情况

按照实验分组培养MHCC97-H细胞，分别在6 h、24 h用流式细胞仪分析细胞凋亡情况，结果表明：与对照组相比，实验组MHCC97-H细胞凋亡增加，随着时间延长，24 h后细胞凋亡显著增加（P<0.05）。见图5、图6。

3 讨论

HCC是中国癌症相关死亡的第二大原因。HCC的转移率和复发率高，预后较差[12-13]，阐明其转移、复发的调控机制仍非常重要。由于肿瘤细胞生长迅速，癌细胞多处于缺氧环境中，缺氧激活缺氧诱导因子，改变细胞的代谢方式，与肿瘤的转移、浸润等均密切相关[14]。因此，探究缺氧环境下肿瘤细胞的生长特性至关重要。人肝癌细胞系取材于原发肝癌组织，并不改变其生物学特性，广泛应用于肝癌细胞的生物学特性、浸润转移机制等方面的研究。CoCl2是常见的化学模拟缺氧的物质，可利用CoCl2构建肝癌细胞缺氧模型。然而目前关于肝癌MHCC97-H细胞对CoCl2反应剂量的报道较少。

研究发现，不同类型肿瘤细胞所需CoCl2浓度可能不相同，在乳腺癌细胞中CoCl2对乳腺癌MCF-7细胞的最佳浓度是150 μmol/L，而对MDA-MB-231细胞的最佳浓度仅为25 μmol/L[11]。翁苓苓等[10]研究了0～800 μmol/L CoCl2处理，对HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Bel-7402肝癌细胞的影响，结果表明，CoCl2在 200 μmol/L内对肝癌细胞的生长无明显作用。其认为200 μmol/L是CoCl2诱导肝癌细胞化学性缺氧的最佳浓度。而本文发现，肝癌MHCC97-H细胞对CoCl2的反应性不同于以上四种细胞株，20 μmol/L CoCl2即对MHCC97-H细胞产生明显影响，导致细胞内HIF2α，G9a和Reptin蛋白表达显著升高、细胞活力降低、细胞凋亡增加。

有研究表明，CoCl2作用机制与氧浓度无关，其比常规缺氧模型更稳定，能调节缺氧相关基因的表达，具有与缺氧相同的调节作用[10]。也有研究指出，CoCl2主要通过钴的积累导致HIF1α表达来模拟缺氧[15]，而本研究发现，CoCl2诱导缺氧同样会导致细胞内HIF2α表达显著增多。据报道，HIF2在肝癌细胞中普遍表达[16]，比HIF1α更易促进肿瘤生长[17]。此外，Reptin是一种ATP酶，参与染色质的重塑和DNA的损伤修复等[18]。研究发现，Reptin沉默与DNA损伤会协同降低肝癌细胞的活力[19]。而本研究发现，CoCl2诱导的缺氧导致肝癌MHCC97-H细胞活力降低，此时Reptin表达是显著增高的，这可能是因Grigoletto 等[19]选用肝癌HuH7细胞，与本研究所用细胞系不同导致，这意味着Reptin与肝癌细胞活力的关系可能因细胞系的不同而不同，值得深入研究。

此外，有文献报道，G9a增多是缺氧依赖的，缺氧条件下Reptin第67位赖氨酸被G9a甲基化，甲基化Reptin结合到HIF1α的启动子上，负向调节缺氧相关基因的转录活性[20]，而本研究表明，CoCl2诱导的缺氧环境下MHCC97-H细胞内G9a表达增多，且Reptin表达增多，可能会导致更多Reptin被G9a甲基化，同时由于HIF2α表达也增多，甲基化Reptin就可能结合到HIF2α的启动子上，参与调节HIF2α下游相关基因的转录活性，从而导致细胞活力降低、细胞凋亡增加，以上提示肝癌中HIF2α和Reptin的联系值得研究。

本研究为未来利用CoCl2构建肝癌MHCC97-H细胞缺氧相关模型奠定基础，并为探究肝癌中HIF2α和Reptin的关系提供了依据，然而由于条件有限，并未研究CoCl2浓度与MHCC97-H细胞间的剂量依赖关系。这也将是笔者后续的研究重点之一。

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（收稿日期：2021-08-22）