大蒜对常见益生菌的体外抑菌活性研究

黄莉来

（平阳县质量检验检测研究院，浙江 温州 325410）

大蒜为百合科葱属植物的地下鳞茎，不仅可作为调味料，还可入药，是著名的食药两用植物。大蒜对人类多种致病菌有抑杀功效，对植物病原菌也有抑制作用。大蒜的抑菌有效成分是大蒜素，大蒜素的化学成分是易挥发的硫醚化合物，包括二烯丙基一硫醚、二烯丙基四硫醚、二烯丙基三硫醚和二烯丙基二硫醚[1]。目前有关大蒜及其提取物对多种病原菌的抑菌试验有较多报道，但对人体益生菌的作用报道较少见，以益生菌为主要活性成分的食品及药品能否与大蒜产品配伍的报道也较少见[2]。枯草杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和酵母菌是常用的肠道益生菌，能促进人体消化吸收，提高机体免疫力，维持肠道菌群结构平衡等。本试验以前人的成果为基础，进一步研究了大蒜抑制有害菌的活性，并对大蒜抑制益生菌活性进行了初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 大蒜及大蒜制品

新鲜大蒜为农贸市场上采购，随机采购15 份大蒜，要求每份大蒜无虫、无霉，瓣肉洁白。经醋、糖、酱油腌制而成的大蒜成品，包括腊八蒜、糖蒜、咸蒜各采购15 份。

1.1.2 试验菌种

益生菌：枯草杆菌（Bacillus subtilis）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和酵母菌（Saccharomyces）。有害菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）和白色念珠菌（Monilia albican）。以上菌种均来自ATCC。

1.1.3 培养基

酵母菌、白色念珠菌采用沙氏葡萄糖液体培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基；保加利亚乳杆菌采用MRS 肉汤和MRS 琼脂；嗜热链球菌采用改良M17肉汤和M17 琼脂。其余菌株的培养采用胰酪大豆胨液体培养基和营养琼脂。

1.1.4 仪器设备

生化培养箱（SHP-150，上海森保实验仪器有限公司）；生物安全柜（HR40-IIA2，青岛海尔特种电器有限公司）；霉菌培养箱（MJ-70F-1,上海一恒科技有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-LS-50SII，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；气相色谱质谱联用仪(GCMS-QP2010Ultra，日本岛津公司)。

1.2 方法

（1）大蒜及其制品的制备。以无菌操作取新鲜大蒜、腊八蒜、咸蒜和糖蒜的蒜瓣，搅碎成蒜泥，称取适量蒜泥，加入相应的液体培养基中稀释，采用试管法倍比稀释，新鲜大蒜稀释成8 个浓度： 100.000 00 mg·mL-1、50.000 00 mg·mL-1、 25.000 00 mg·mL-1、12.500 00 mg·mL-1、 6.250 00 mg·mL-1、3.125 00 mg·mL-1、1.562 50 mg·mL-1和0.781 25 mg·mL-1。腊八蒜稀释成8 个浓度：800.00 mg·mL-1、400.00 mg·mL-1、200.00 mg·mL-1、100.00 mg·mL-1、50.00 mg·mL-1、25.00 mg·mL-1、12.50 mg·mL-1和6.25 mg·mL-1。咸蒜和糖蒜稀释成6个浓度：10 000.0 mg·mL-1、5 000.0 mg·mL-1、 2 500.0 mg·mL-1、1 250.0 mg·mL-1、625.0 mg·mL-1和312.5 mg·mL-1。

（2）菌悬液的制备。取试验菌新鲜培养物，用生理盐水稀释至105～106CFU·mL-1，制成菌悬液备用。

（3）最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）的测定。在上述试管中，加入菌悬液0.05 mL，另设培养液对照。培养后肉眼观察认为无菌生长的试管浓度为最小抑菌浓度。

（4）最小杀菌浓度的测定（Minimum Bactericidal Concentration，MBC）。再以0.01 mL 接种环取肉眼观察认为无菌生长的试管接种一环于相应的固体培养基中，能杀死99.9%原始种入的细菌浓度即为该菌的最小杀菌浓度。

（5）培养条件。细菌在36 ℃恒温下，培养24 ～48 h；真菌在28 ℃恒温下，培养48 ～72 h。

（6）大蒜素含量的测定。大蒜的生物效应主要来自其特有的有机硫化物——大蒜素及其衍生物。完整的大蒜不含生物活性的大蒜素，以不稳定的蒜氨酸形式存在，大蒜经机械破碎，经蒜氨酸酶的催化生成了大蒜素。大蒜素主要成分为二烯丙基三硫醚，目前多采用气相色谱法和气相色谱质谱联用法测定[3]。相较于气相色谱法，气相色谱质谱联用法检测灵敏度高，定性可靠，其含量以二烯丙基三硫醚的检测结果计。

2 结果与分析

2.1 大蒜素的含量测定结果

新鲜大蒜、腊八蒜、咸蒜和糖蒜各15 份，计算二烯丙基三硫醚的平均值，结果见表1，从高到低排序：新鲜大蒜＞腊八蒜＞咸蒜＞糖蒜。二烯丙基三硫醚在新鲜大蒜中的含量明显高于其他3 种，将新鲜大蒜和腊八蒜的二烯丙基三硫醚的含量进行T检验，t值为6.374 6，P＜0.05，有显著性差异，新鲜大蒜的大蒜素含量高于腊八蒜。

表1 大蒜及大蒜制品二烯丙基三硫醚的含量表

研究表明，大蒜素的稳定性受多种因素影响，如温度、pH 值、紫外线和保存时间。大蒜素在偏酸的环境中相对稳定，15 份腊八蒜的pH 值最小的为3.78，最大的为4.21。腊八蒜由于在酸性环境中，大蒜素可保存较长时间，含量高于咸蒜和糖蒜[4]。

2.2 新鲜大蒜的抑菌和杀菌活性

新鲜大蒜对真菌和细菌有很强的抑杀作用， 15 份新鲜大蒜其中13 份样品在1.562 5 mg·mL-1的浓度下即对白色念珠菌和酵母菌产生抑制，经T检验，t值为0.096 05，P＞0.05，对二者的抑菌效果无显著性差异。有7 份样品在3.125 mg·mL-1的浓度即可杀死这两种真菌。金黄色葡萄球菌和保加利亚乳杆菌的MIC 经T检验，t值为0.140 4，P＞0.05，同样对二者的抑菌效果无显著性差异。

2.3 MIC 和MBC 测定结果

由表2 可知，在体外条件下，4 种益生菌对大蒜敏感，腊八蒜次之，咸蒜和糖蒜的抑杀活性微弱，这与大蒜素的含量高低有关。因此建议服用含酵母菌、枯草杆菌、嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌等益生菌制剂者，最好不要同时食用大蒜,否则有可能导致益生菌制剂不能发挥作用。

表2 大蒜及大蒜制品对试验株的MIC 和MBC 平均浓度表（单位：mg·mL-1）

2.4 新鲜大蒜对4 种益生菌的抑菌强度比较

由表3 可看出，15 份样品的大蒜素含量差距不明显。大蒜对酵母菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、枯草杆菌的抑菌效果不同。对酵母菌最强，在很低的浓度就能抑制其生长。其次是枯草杆菌，最后是保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。

表3 新鲜大蒜对4 种益生菌的抑菌强度比较结果表

大蒜对真菌有很强的杀伤作用，研究证实，大蒜素能够破坏氧化还原平衡（还原型谷胱甘肽被氧化），导致酵母细胞凋亡。大蒜素还能通过抑制不同的转录因子（YAP1、MSN2/4、RPN4 和SKN7 等），降低一些重要酶类的基因表达，包括氨基酸代谢（尤其是蛋氨酸）、铁摄取、呼吸链、硫胺素代谢和蛋白酶体的蛋白质降解过程[5]。

3 结论

综上所述，大蒜对试验益生菌及有害菌均有抑制作用，两组微生物并无显著性差异。大蒜对人体有害菌的抗菌优势使其能用于防病保健，但要注意与活菌制剂及食品的配伍，二者应分开使用。本次实验只选了4 种益生菌进行研究，大蒜对其他益生菌是否具有抑制作用有待进一步研究。大蒜的抑菌活性说明大蒜不仅可应用于医疗保健领域，还可应用于食品保鲜[6]。此外，大蒜油有刺激性的气味且理化性质不稳定，若能对其进行脱臭处理并制成相关剂型以保持其稳定性，可使其有更广阔的市场应用。