银杏叶中奎宁酸和莽草酸的综合提取研究

2022-04-27李俊陈伟杨明武何珺

应用化工 2022年2期

李俊，陈伟，杨明武，何珺

(1.贵州大学药学院，贵州贵阳 550025;2.贵州省生化工程中心，贵州贵阳 550025)

银杏叶为银杏科植物银杏(Ginkgobilobea.L.)的干燥叶,味微苦,性平,具有益心、活血止痛等功效[1-4]。银杏叶中的活性成分有黄酮、萜内酯和有机酸等[5]，其中奎宁酸和莽草酸含量高达3%～5%。奎宁酸具有抗氧化性[6]，莽草酸具有抗菌、抗炎等药理活性[7]。

莽草酸、奎宁酸为合成达菲原料[6，8]。目前市场上莽草酸主要来源于八角，但近年来八角价格不断攀升，导致工业成本提高，市场急需寻求低价原料代替[9-11]。在银杏叶中黄酮及内酯提取工艺基础上[7]，对莽草酸和奎宁酸进行综合提取工艺研究，充分利用银杏叶资源。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

奎宁酸对照品(批号20112423，上海同田生物技术股份有限公司，含量>98%)；莽草酸对照品(批号20111203，上海同田生物技术股份有限公司，含量>98%)；磷酸、无水乙醇均为分析纯；娃哈哈纯净水；甲醇，色谱纯；蒸馏水,自制;银杏叶，4月采自贵州省遵义市湄潭县3年树龄的银杏，60 ℃真空干燥24 h。

Agilent Technologies 1260 InfinityHPLC-示差检测器;BT25S电子分析天平；HH.W21-600C型电热恒温水浴锅。

1.2 提取实验

按料液比1∶10 g/mL;加入体积分数85%的乙醇，在70 ℃提取2 h。

1.3 奎宁酸和莽草酸含量测定

1.3.1 色谱条件色谱柱：Agilent C18柱(250×4.6 mm,5 μm)；流动相为甲醇：0.4%磷酸水(1∶99，v/v)；柱温35 ℃；流速0.8 mL/min；进样量10 μL。

1.3.2 溶液制备分别取奎宁酸、莽草酸对照品适量，精密称定，加水制得对照品溶液。精密称定银杏叶1.00 g，按照相应条件提取，精密移取银杏叶提取液1 mL，以水定容至10 mL，摇匀，经 0.45 μm 微孔滤膜滤过，注入进样瓶，即得供试品溶液。按拟定色谱条件进行含量测定，结果见图1、图2。

图1 对照品色谱图Fig.1 Chromatogram of reference substance

图2 供试品色谱图Fig.2 Chromatogram of the test product

1.3.3 标准曲线绘制精密量取 0,2.4,4,6,8,10 mL的0.25 mg/mL奎宁酸标准溶液于10 mL试管中，加水稀释至刻度线，混匀，制成系列奎宁酸标准溶液；精密量取0,1.6,3.2,3.5,4.8 mL的0.15 mg/mL莽草酸标准储备液于10 mL试管中，加水稀释至刻度线，混匀，制成系列莽草酸标准溶液。按照拟定方法条件进行含量测定。以奎宁酸质量浓度(mg/mL)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=115 477X+136.4，r=0.99，表明在0～ 0.25 mg/mL 范围内，峰面积与奎宁酸浓度有良好的线性关系。以莽草酸质量浓度(mg/mL)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=132 125X+190.39，r=0.99，表明在0～0.30 mg/mL 范围内，峰面积与莽草酸浓度有良好的线性关系。

2 结果与讨论

2.1 提取温度

料液比1∶10 g/mL,乙醇体积分数85%，提取时间2 h，考察提取温度对提取效果的影响,结果见表1。

表1 提取温度对奎宁酸和莽草酸提取影响(n=3)Table 1 The effect of extraction temperatures on the extraction of quinic acid and shikimic acid (n=3)

由表1可知，随着温度升高，银杏叶中奎宁酸和莽草酸提取率越高，70,90 ℃时，奎宁酸和莽草酸提取含量最高，达3.8%左右，变化不大。因此，优先提取温度为70 ℃。

2.2 提取醇浓度

料液比1∶10 g/mL，提取温度70 ℃，提取时间2 h，考察乙醇体积分数对提取效果的影响,结果见表2。

表2 乙醇浓度对奎宁酸和莽草酸提取影响(n=3)Table 2 The effect of ethanol concentrations on the extraction of quinic acid and shikimic acid (n=3)

由表2可知，乙醇浓度越高，奎宁酸提取率越低，而莽草酸整体提取率变化不大。乙醇体积分数在30%时，奎宁酸含量达4.5%，莽草酸含量达3.9%，综合提取率最高。但是，先前对银杏叶中黄酮、内酯、莽草酸综合提取研究表明，采用乙醇浓度为70%最好，而70%乙醇提取奎宁酸提取效果为30%提取时的84.3%。因此，考虑银杏叶中黄酮、内酯、莽草酸三个组分提取效率，确定提取溶剂为70%乙醇。

2.3 提取时间及次数的考察

料液比为1∶10 g/mL，提取温度为70 ℃，乙醇体积分数为70%，每次提取1 h，每次提取后进行抽滤，滤渣进行下一次提取。提取次数对提取效果的影响见表3。

表3 提取次数对提取效果的影响(n=3)Table 3 The influence of the number of extractions on the extraction effect(n=3)

由表3可知，第1次提取时，莽草酸提取率达70.35%，奎宁酸提取率达60.15%；第2次提取时，莽草酸总的提取率达20.55%，奎宁酸总的提取率达25.78%；第2次提取时，奎宁酸总的提取率为9.97%，莽草酸总的提取率为6.88%；第4次提取时，奎宁酸和莽草酸的提取率低至3.33%和2.33%。因此，综合生产成本考虑，确定提取2次，第1次提取2 h，2次提取1 h，总的提取时间为3 h，奎宁酸总的提取率为96.67%，莽草酸总的提取率为97.77%。

2.4 正交实验

在单因素实验基础上，对料液比、乙醇体积分数、提取温度、提取时间进行正交实验，因素水平见表4，结果见表5，方差分析见表6、表7。

表4 因素水平表(n=3)Table 4 Factor and level table (n=3)

表5 正交实验结果(n=2)Table 5 Orthogonal experimental results (n=2)

表6 奎宁酸提取方差分析Table 6 Results of analysis of variance of quinic acid

表7 莽草酸提取方差分析Table 7 Analysis of variance results of shikimic acid

由表5可知，莽草酸含量变化不大，而奎宁酸含量波动较大。所以，将奎宁酸作为正交提取含量考察主要指标，因素的影响强度依次为B>D>C>A,A1B1C3D3为最优方案,即料液比1∶8 g/mL,乙醇体积分数为70%，提取温度为70 ℃，提取时间3 h。

2.5 验证实验

平行取4组1.0 g银杏叶，精密称定，加8 mL体积分数为70%的乙醇溶液，70 ℃条件下，提取2次，即第1次为2 h，第2次为1 h,提取时间3 h。对提取液进行含量测定，综合评分=奎宁酸含量评分+莽草酸含量评分;奎宁酸含量评分=(奎宁酸提取量/奎宁酸最大提取量)×100×0.5;莽草酸含量评分= (莽草酸提取量/莽草酸最大提取量)×100×0.5。结果见表8。