垃圾填埋场中不同填埋年限固体废弃物的抗生素抗性基因污染特征*

李中浤 李晓光 黎佳茜 陈素华

(1.南昌航空大学环境与化学工程学院，江西 南昌 330063；2.中国环境科学研究院,国家环境保护地下水污染过程模拟与控制重点实验室，北京 100012)

抗生素在医学发展、现代农业和畜牧业中发挥着重要的作用[1]，中国作为世界上抗生素最大的生产者和使用者之一，每年生产和消费的抗生素分别达到24.8万、16.2万t[2]。抗生素一直存在过度使用和长期滥用的现象，过量服用的抗生素会随排泄物进入环境，导致环境中具有抗生素抗性基因(ARGs)和携带有抗生素抗性的耐药菌(ARB)大量增加[3]。随着越来越多具有多重耐药性的“超级细菌”的出现，抗生素耐药性对人类健康构成了极大的威胁[4]。目前，在城市污水处理厂[5]、湖泊[6]、农田土壤[7]、河流[8]、空气[9]等各类环境介质中均检测出ARGs[10]。ARGs作为一种新型污染物已成为21世纪全球公共卫生的最大威胁之一[11]。

垃圾填埋场是城市固体废弃物的最终处置场所，全球垃圾填埋场每年接受约3.5亿t城市固体废弃物，其中大量过期抗生素类药物会随着生活垃圾进入垃圾填埋场中，使得城市垃圾填埋场成为抗生素和ARGs的重要“源”和“汇”[12]。除了抗生素外，垃圾填埋场中各种重金属和有机污染物的存在也会影响ARGs和ARB的传播[13]。WANG等[14]调查了3个垃圾填埋场中不同填埋年限的固体废弃物中抗生素和ARGs浓度，结果显示在检测的15种抗生素中有14种抗生素在填埋年限较短的固体废弃物中浓度较高，这可能是由于不同抗生素具有不同的物理化学性质，导致在固体废弃物中的吸附能力有所差异，而且微生物活性和生物降解特征的不同也是导致抗生素浓度出现差异的重要原因之一[15]。相反，在固体废弃物中检测出的多种ARGs却呈现出随着填埋年限的增加而增高的趋势。目前关于垃圾填埋场固体废弃物ARGs的研究主要是针对磺胺类、四环素类、喹诺酮类等少数几种抗生素的ARGs，如sul1、sul2、tetA、tetC、qnrA、qnrB等，无法全面反映垃圾填埋场中ARGs的种类和分布格局。

目前，越来越多的基于脱氧核糖核酸(DNA)的分子生物学技术用于检测和定量分析环境中的ARGs，如聚合酶链式反应(PCR)、实时定量PCR、荧光定量PCR(qPCR)、高通量PCR和宏基因组测序技术(mNGS)等[16]。其中，mNGS可克服PCR、qPCR和高通量PCR检测技术引物或探针设计与选择的限制，获得环境中所有抗性基因的序列信息，并挖掘未知抗性基因的信息[17]，因此mNGS已经成为研究环境中ARGs的有效方法。然而，应用该技术对垃圾填埋场中ARGs的研究却鲜有报道。为此，本研究以内蒙古巴彦淖尔市的某垃圾填埋场为研究对象，采用mNGS对不同填埋年限固体废弃物中ARGs的分布规律和污染水平进行分析，以期为固体废弃物ARGs的污染状况、扩散及传播规律研究提供基础信息。

1 材料与方法

1.1 样品采集及预处理

内蒙古巴彦淖尔市某垃圾填埋场位于临河城北郊，距市中心7 km，建设规模为日处理生活垃圾450 t，设计库容为129.94万m3。本研究于2020年11月20日分别采集了填埋年限分别为2、5、8年的表层固体废弃物，-4 ℃冷藏运回实验室，使用冻干机进行冻干处理，去除塑料袋、砂石等大颗粒物质后进行研磨，过40目筛网后置于-40 ℃冰箱冷冻保存，用于DNA提取。

1.2 DNA提取

采用土壤DNA快速提取试剂盒(美国MP)完成固体废弃物DNA抽提，而后利用1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测抽提基因组DNA的纯度和完整性，采用Qubit 2.0型荧光光谱仪(美国Thermo Scientific)检测PCR扩增后DNA的产量。基因组DNA样品用干冰保藏并立即送样测序，测序平台使用NovaSeq 6000(美国illumina)，采用PE150测序策略进行双端测序。

1.3 测序及生物信息学分析

参考文献[16]，使用Trimmonatic软件对原始测序数据进行质量控制，去除低质量测序数据，得到有效测序数据，应用USEARCH和BlastX软件将测序数据与构化抗生素耐药基因(SARG)数据库进行对比注释[18]，对注释后的数据参照SARG数据库将ARGs分成不同的抗性类型，包括氨基糖苷类、杆菌肽类、β-内酰胺类、博来霉素类、碳霉素类、氯霉素类、磷霉素类、膦胺霉素类、镰刀菌酸类、夫西地酸类、春雷霉素类、大环内酯-林可胺-链霉杀阳菌素类、多药类、多黏菌素类、嘌呤霉素类、喹诺酮类、利福霉素类、壮观霉素类、磺胺类、特曲霉素类、四环素类、甲氧苄氨嘧啶类、万古霉素类和未分类。参考文献[17]，将检测结果基于16S拷贝数标准化，计算出不同抗性类型ARGs的相对丰度。

2 结果与讨论

2.1 ARGs抗性类型和相对丰度变化

基于SARG数据库比对结果，3种固体废弃中共检测出21类ARGs，镰刀菌酸类、夫西地酸类和壮观霉素类ARGs未检出。其中填埋2、5、8年的固体废弃物中分别检测出19、18、20类ARGs，总相对丰度分别达3.783×10-1、4.267×10-1、6.741×10-1。碳霉素类、嘌呤霉素类ARGs仅在填埋8年的固体废弃物中测出；春雷霉素类ARGs在填埋2、5年的固体废弃物中检出；特曲霉素类ARGs在填埋2、8年的固体废弃物中检出。不同ARGs的相对丰度分布见图1。

由图1可见，氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类、磺胺类、利福霉素类、喹诺酮类和甲氧苄氨嘧啶类ARGs的相对丰度均随着填埋年限的增加而增加，杆菌肽类、未分类ARGs的相对丰度随填埋年限的增加而降低，相对丰度较高的大环内酯-林可胺-链霉杀阳菌素类、多药类、万古霉素类ARGs的相对丰度随填埋年限的增加变化规律不明显。甲氧苄氨嘧啶类、磺胺类ARGs随着填埋年限的增加相对丰度增长比例相对明显，其中甲氧苄氨嘧啶类ARGs在填埋年限2、8年的固体废弃物中相对丰度分别为1.325×10-4、6.193×10-3，相对丰度增加了45.74倍。整体相比，填埋8年的固体废弃物中ARGs的总相对丰度比填埋2年的固体废弃物增加了2.958×10-1。王柳红等[19]研究表明垃圾渗滤液年限与ARGs相对丰度呈正相关，但YU等[20]研究发现随着填埋年限的增加，固体废弃物中ARGs相对丰度会下降。造成该差异的主要原因可能是垃圾填埋场中ARGs不仅仅与填埋年限有关，也与垃圾填埋场中重金属、光照、有机物、营养盐以及微生物群落结构等因素变化有关。

图1 固体废弃物中不同ARGs的相对丰度Fig.1 The relative abundance of different ARGs in solid waste

依据优势ARGs的判断标准(在样本组中的相对丰度占比≥1%)，对固体废弃物中的优势ARGs进行统计，结果见表1。

由表1可见，随着填埋年限的增加，固体废弃物中个别优势ARGs种类和相对丰度发生了变化。填埋2年的固体废弃物中共有11类优势ARGs，丰度占比从大到小依次为大环内酯-林可胺-链霉杀阳菌素类、多药类、万古霉素类、杆菌肽类、氨基糖苷类、未分类、四环素类、氯霉素类、膦胺霉素类、磺胺类和利福霉素类；填埋5年的固体废弃物中共有10类优势ARGs，丰度占比从大到小依次为大环内酯-林可胺-链霉杀阳菌素类、多药类、氨基糖苷类、氯霉素类、磺胺类、杆菌肽类、四环素类、万古霉素类、未分类和β-内酰胺类；填埋8年的固体废弃物中共有8类优势ARGs，丰度占比从大到小依次为大环内酯-林可胺-链霉杀阳菌素类、磺胺类、多药类、氯霉素类、氨基糖苷类、四环素类、万古霉素类和杆菌肽类。3种固体废弃物所共有的8类优势ARGs相对丰度占比合计均在90%以上，是固体废弃物中最主要的ARGs。ZHAO等[21]通过使用mNGS技术分析了中国12座城市垃圾填埋厂中ARGs的分布特征，也发现大环内酯-林可胺-链霉杀阳菌素类、氨基糖苷类、多药类和四环素类是ARGs的主要抗性类型，其相对丰度占比达到71.1%～93.0%。

表1 固体废弃物中优势ARGs相对丰度的占比Table 1 The proportion of the relative abundance of advantage ARGs in solid waste %

2.2 ARGs亚型的种类

不同填埋年限的固体废弃物中共有及特有的ARGs亚型数目见图2。

3种固体废弃物中共检测出259种ARGs亚型，高于CHI等[22]在医废堆置区内检测出的ARGs亚型数。其中填埋2、5、8年的固体废弃物中分别检测出160、196、206种ARGs亚型，特有的ARGs亚型分别有12、23、36种，3种固体废弃物中共有的ARGs亚型有115种，数目占比达44.4%。随着填埋年限的增加，固体废弃物中ARGs亚型的数目也随之增加。填埋2年的固体废弃物中mefA的相对丰度最高，填埋5、8年的固体废弃物中均为ermF相对丰度最高，mefA、ermF均属于大环内酯-林可胺-链霉杀阳菌素类ARGs。

图2 不同填埋年限固体废弃物中共有和特有的ARGs亚型数目Fig.2 The number of mutual and unique ARGs subtypes in the solid waste with different ages

抗生素和ARGs广泛存在于各种环境媒介中[23]，其中四环素类和磺胺类ARGs传播最广泛，对人体潜在危害最大，也是垃圾填埋场中研究较多的ARGs类型。为此，本研究对不同填埋年限的固体废弃物中四环素类和磺胺类ARGs亚型进行进一步分析。本研究共检测出4种磺胺类ARGs亚型，分别为sul1、sul2、sul3、sul4。在填埋2、5、8年的固体废弃物中，磺胺类ARGs相对丰度分别5.031×10-3、2.966×10-2、1.416×10-1，增幅十分明显。sul2是填埋8年的固体废弃物中所特有的ARGs亚型，sul1的相对丰度呈现出随填埋年限的延长而增加的趋势，而SONG等[24]研究结果与本研究相反，认为sul1的相对丰度与填埋年限呈负相关，这可能是不同垃圾填埋场存在一定差异性从而导致个别ARGs亚型变化趋势的不同。

3种固体废弃物中共检测出27种四环素类ARGs亚型，其中在填埋2年的固体废弃物中，四环素类ARGs相对丰度为1.055×10-2，随着填埋年限延长到5、8年，四环素类ARGs相对丰度分别增加到1.954×10-2、5.076×10-2，可能是固体废弃物中含有一定的四环素类抗生素残留，从而产生较大的选择压力，有利于四环素类ARGs的增加和传播[25]。综上可知，随着填埋年限的增加，固体废弃物中ARGs的丰度以及多样性均会随之增加，从而增加其潜在环境风险。

3 结 论

(1) 基于mNGS从填埋2、5、8年的固体废弃物中检测出19、18、20类ARGs，总相对丰度分别为3.783×10-1、4.267×10-1、6.741×10-1，表明城市生活垃圾填埋场是ARGs的重要储存库。

(2) 3种固体废弃物所共有的8类优势ARGs分别为大环内酯-林可胺-链霉杀阳菌素类、磺胺类、多药类、氯霉素类、氨基糖苷类、四环素类、万古霉素类和杆菌肽类，相对丰度占比合计均在90%以上，是固体废弃物中最主要的ARGs。

(3) 固体废弃物中共检测出259种ARGs亚型，其中填埋2、5、8年的固体废弃物中分别检测出160、196、206种ARGs亚型，相对丰度最高的ARGs亚型均属于大环内酯-林可胺-链霉杀阳菌素类。

(4) 固体废弃物ARGs中检测出4种磺胺类和27种四环素类ARGs亚型。随着填埋年限的增加，固体废弃物中ARGs的丰度以及多样性也会随之增加，从而使潜在环境风险逐渐增大。