血清及支气管肺泡灌洗液GM试验对侵袭性肺曲霉病的诊断价值

张 鸽 苏 琳 高顺翠 乔 青

济南市第四人民医院呼吸与危重症医学科，山东 济南 250031

肺真菌病是最常见的深部真菌病，包括肺念珠菌病、肺曲霉病、肺隐球菌病及肺孢子菌肺炎等。近年来，肺曲霉菌发病呈上升趋势，其中最常见的是侵袭性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis,IPA)，它对肺组织破坏严重，治疗困难，病死率高。该病在免疫力低下人群中好发，例如长期粒细胞缺乏的患者，合并有慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmoriary disease, COPD)及自身免疫性疾病的患者，异体造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)受者、实体器官移植(solid organ transplant,SOT)受者等，并与不规范应用广谱抗生素有密切的关系［1］。该病是导致遗传性或者获得性免疫缺陷人群发生致命性感染的重要原因。IPA 如若得不到及时的诊断和治疗，患者可能出现临床预后较差、甚至死亡的后果［2］。IPA的确诊有赖于曲霉菌培养及组织病理学检查，但上述手段前者培养时间长，后者为有创伤性操作，且阳性率均偏低［3］，导致在临床上应用受限。真菌抗原的检测手段目前在临床得到广泛的应用，GM试验试剂盒检测的成分是半乳甘露聚糖抗原，感染IPA 的曲霉菌细胞壁含有该成分，当曲霉菌侵入机体后，半乳甘露聚糖即释放出来被检测到，且该物质释放的比较早，在临床或影像学改变之前就能被检测到［4］，被广泛应用于侵袭性曲霉菌感染的早期筛查和辅助诊断［5］。但BALF GM 诊断阈值的选择及其特异度及敏感度的评价还存在较大的差异［6-7］。一个相对大型的临床研究提示BALF的GM界值越高，对IPA诊断的特异度越高，但灵敏度下降［8］。因此对BALF的GM试验如何选择合适的阈值来提高诊断的特异度及灵敏度，值得临床探讨。本研究对拟诊及临床诊断的IPA患者进行血清及BALF的GM试验的检测，探讨上述两种检测手段在IPA早期诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2018年1月至2020年12月入住济南市第四人民医院呼吸与危重症医学科及其它临床科室收治的肺部感染患者 72 例，男 38 例，女 34 例；年龄18 ～ 83 岁，中位年龄 50.3 岁。参照 2008 年欧洲癌症研究和治疗组织/真菌病研究组（EORTC/MSG）和2016年IDSA曲霉病诊断临床实践指南，拟诊标准：呼吸道标本（痰液、BALF 液或支气管毛刷）镜检真菌成分为曲霉菌，或胸部CT 有晕征、空洞、空气新月征等典型表现，且患者为免疫抑制宿主；确诊标准为：组织病理学依据和无菌部位的真菌培养有曲霉属生长。排除标准为应用β-内酰胺类抗生素患者。将我院拟诊及临床确诊IPA 患者42 例归为病例组（拟诊及临床诊断患者经抗真菌治疗后临床症状及胸部CT均好转作为入组标准），其余同期30例细菌性肺炎患者作为对照组，签署知情同意书。对所有入组患者的宿主因素进行分析，患者多合并基础性疾病，包括COPD（18/72）、支气管扩张（14/72）、哮喘（9/72）、结缔组织病（7/72）、间质性肺疾病（7/72）、慢性肾功能不全（6/72），曾多次住院治疗甚至入住重症监护室，长期反复应用糖皮质激素、免疫抑制剂及广谱类抗生素等，有些为血液系统、淋巴系统及其他实质脏器晚期肿瘤患者（8/72）及需要无创呼吸机辅助通气、插管有创呼吸机辅助通气患者，其余无基础疾病患者3例（3/72），宿主分析两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。病例组患者临床表现无明显特异性，常有发热、咳嗽、咳粘痰、咯血伴气短等临床症状，经抗生素治疗无效，胸部CT表现为多发肺结节、晕征、空洞及空气新月征等，但非IPA 的特异性诊断［9］。GM 试验在 2008 年即被建议用于曲霉菌高危患者的筛查，在2016年给出了更详细准确的推荐意见。由于纤维支气管镜BALF液的获取相对简单，目前BALF的GM试验在肺部真菌感染的诊断过程中越来越受到临床医生的重视［10-11］。

1.2 BALF收集

按常规支气管镜检查操作流程进行术前准备，按支气管镜检查操作SOP 进行BALF 收集，术前给予2%利多卡因局部麻醉，经鼻行电子纤维支气管镜检查，阅胸部CT，依CT定位点将支气管镜进入目标支气管内，注入生理盐水40 ～60 mL，进行肺泡灌洗检查，回收10 ～20 mL BALF 液，放入硅塑瓶中，4 ℃保存待测。4 h内完成GM检测。

1.3 血清GM试验标本

行支气管镜检查采集BALF 的当日清晨，使用真空采血管采血3 mL，4 000 r/min 离心10 min，4 ℃冰箱保存等待检测。

1.4 仪器与试剂

GM 试剂盒（ELISA）购自丹娜生物科技有限公司；酶标仪购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。采用微孔双抗体夹心酶免疫法进行GM试验。血清GM 数值计算公式：Ⅰ值=待测标本吸光度/标准血清吸光度。根据计算结果，分别以0.5、1.0、2.0 作为诊断阈值，计算各诊断阈值下的灵敏度、特异度。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以率表示，组间比较采用卡方检验。以配对t检验比较血清和BALF标本GM的Ⅰ值的差异。计算血清及BALF标本在不同诊断阈值下GM试验诊断IPA的敏感度、特异度；绘制ROC曲线用于比较血清及BALF GM试验的诊断价值。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 血清和BALF的GM试验检测结果

病例组的血清及BALF的GM结果较高，高于对照组，差异具有统计学意义（P＜ 0.05），见表1。

表1 病例组及对照组血清GM试验及BALF GM试验结果比较

2.2 血清及BALF的GM试验在不同阈值诊断标准下的诊断效能分析

分别以0.5、1.0、1.5 作为诊断阈值，计算各值作为阈值时的GM试验诊断IPA 的敏感性、特异性、Youden指数。以Youden指数最高为原则，确定诊断阈值，本研究得到血清GM 试验以＞0.5 为诊断阈值；BALF的GM试验以＞1.0为诊断阈值。见表2。

表2 病例组血清、BALF GM试验不同阈值下诊断效能评估

2.3 绘制ROC曲线

ROC曲线以敏感度为纵坐标，以特异度为横坐标，根据二分类方式绘制。数据在任意界限值对疾病的诊断性能，可通过该曲线很容易的查出。ROC曲线越靠近左上角，面积约接近于1，说明诊断效果较好。错误最少的阈值是最靠近左上角的ROC 曲线的点，也是假阳性和假阴性最少的阈值。该统计过程通过SPSS 21.0实现。BALF GM试验用于诊断IPA 的 ROC 曲 线 AUC 为 0.881（95%CI：0.806～1.000，P ＜0.05），将BALF GM试验诊断阈值设置为1.0时，Youden指数最大，此时敏感度为74.0%，特异度为73.8%。而血清GM 试验用于诊断IPA 的ROC曲 线 AUC 为 0.824（95%CI：0.570～0.865，P＜0.05），以丹娜公司试剂盒提供的参考值0.5为诊断阈值，Youden指数最大，其诊断敏感度为42.6%，特异度为93.4%。见图1。

图1 血清及BALF的GM试验诊断IPA的ROC曲线

3 讨 论

IPA是曲霉菌孢子发育成熟并侵袭破坏肺组织引起的一类疾病。病原菌为曲霉菌，其中以烟曲霉最常见（50%～60%）。烟曲霉常定植在上呼吸道，在宿主免疫力正常时，所引起的临床症状相对不重，但宿主免疫力低下时可出现IPA，临床症状重，病死率较高，临床上必须给予足够重视。IPA胸部CT特征有结节伴晕征、实变、严重程度不同的支气管扩张、支气管黏液栓，但均非特异性病变［12］，有些患者典型的CT表现为结节、空洞、晕轮征、新月体征等，但临床上单纯依靠胸部CT 很难诊断IPA。曲霉菌培养及组织病理学是诊断曲霉菌感染的标准，但临床应用存在局限性。若IPA 不及时诊断，将导致患者预后较差甚至死亡［13］。支气管肺泡灌洗技术对肺部感染性疾病的诊断起到重要的作用［14］，所送检的GM 试验优于血清 GM 试验，被广泛应用于临床［15］。相关研究指出，GM试验被认为是诊断IPA的可靠标志，也可用于临床观察IPA患者预后［16］。GM检测的临床应用在血清和BALF 中得到认可和验证，与真菌病原及病理检测相比，其阳性可更快获得且创伤更小，因此可以更早地开始抗真菌治疗。

本研究中病例组患者感染曲霉菌后，血清及BALF GM 水平均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。曲霉菌进入机体后释放大量的半乳甘露聚糖进入血液或BALF 液中，而对照组患者血清或者BALF液中的GM试验结果阳性，多为其他因素所导致的假阳性结果，例如曲霉菌与其他类真菌（新型隐球菌、镰刀菌、青霉菌）及β-内酰胺类抗生素有相交叉反应［17］，因此会出现假阳性结果，故GM标本的获得应在使用β-内酰胺类抗生素之前获得。另外，研究表明，非粒缺曲霉菌患者，白细胞会吞噬GM抗原，亦可造成GM试验假阴性。一项大样本研究表明，BALF-GM 联合血清GM 检测用于IPA 诊断与临床诊断结果具有更高符合率，效能优于两者单用［18］。

本研究绘制血清及BALF GM 试验诊断IPA 的ROC 曲线，得到各自对应的诊断阈值，分别为0.5、1.0。在血清GM 阈值为0.5 时其敏感度为42.6%，特异度为93.4%，BALF GM 阈值为1.0 时其敏感度为74%，特异度为73.8%，因此为同时提高GM试验对IPA诊断的敏感度及特异度，可联合血清及BALF的GM试验检查。在临床实践中两组检查联合应用可提高IPA 确诊率，尽早抗曲霉菌治疗，促进患者康复。

综上所述，本研究发现，血清及BALF 的GM 试验均对IPA有比较好的诊断价值，相对于血清来说，BALF 的GM 试验效果更优，且得出其新的诊断阈值，以供实验室和临床参考。唐安珏等［19］研究表明，在支气管镜BALF液的获取过程中，临床操作顺序对GM 值存在影响，故需要科学地留取灌洗液标本，但目前留取标本的操作步骤尚无统一的临床操作准则，本研究采用支气管镜检查操作SOP 进行BALF 收集，规范操作，减少误差。研究提示BALF GM界值越高，对肺曲霉病诊断的特异度越高，但灵敏度下降［20］，本研究所得结果与此相符。在临床实践中为提高IPA 的临床诊断的准确性，可根据患者病情需要联合检测血清和BALF的GM水平，为辅助诊断IPA提供参考依据。但由于本研究的样本数量有限，确定的诊断阈值可能存在一定的误差，为提高IPA 确诊率，今后，我们将加大样本量，确定合适的诊断阈值，用于指导早期抗真菌治疗，降低死亡率，改善患者的生活质量。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突