吸入高浓度H2对高脂饮食大鼠血浆和肝脏中磷脂和鞘脂分子的影响

谢云博 刘伯言 陈 军 张 驰 赵 敏 秦树存 王义围

1.承德医学院附属医院全科医疗科，神经内科，河北 承德 067000；2.山东第一医科大学第二附属医院，泰山氢生物医学研究院，山东 泰安 271000

1975 年 Dole 等［1］首次提出 H2可用于治疗疾病的概念，但并未得到学术界的广泛关注，直到2007 年 Ohsawa 团队取得了突破性进展［2］。从此氢医学进入了快速发展阶段。经过半个世纪的发展，氢分子（hydrogen molecule，H2）作为一种新型医学气体分子，在缺血性组织损伤［3］、糖脂代谢紊乱［4］、肺功能障碍［5-6］等多种疾病的治疗方面表现出了一定的作用。血浆中常见的脂蛋白包括低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）和高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）两种，其中，LDL与动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）呈正相关，而HDL与AS呈负性关［7］。研究已表明，H2可以降低血液循环中总胆固醇和 LDL 胆固醇水平［8］，提高 HDL 功能［9］，减少肝脏脂质堆积［8］。

磷脂是组成生物膜的主要成分，也是循环中脂蛋白的主要脂质成分。磷脂为两性分子，一端为亲水的含氮或磷的头部，另外一端为疏水的长烃基链尾部。甘油磷脂是机体含量最多的磷脂，根据极性头部组成不同，可分为磷脂酰胆碱（phosphatidylcholines，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamines，PE）、磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserines，PS）、磷脂酰肌醇 （phosphatidylinositols，PI） 、甘 油 磷 脂 酸（phosphatidicacid，PA）、心磷脂（cardiolipin，CL）、缩醛磷脂（plasmalogen）等［10］。磷脂水解产生的溶血磷脂如溶血磷脂酰胆碱（lysophophatidylcholine，LPC）、溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidylethanolamine，LPE）等，被认为是缺血性脑卒中［11］、肥胖、高胆固醇血症［12］等多种疾病的生物标志物。鞘脂是一类含有鞘氨醇骨架的两性脂，一端连接着一个长链的脂肪酸，另一端为一个极性的醇；主要包括鞘磷脂（sphingomyelin，SM）、神经酰胺（ceramide，Cer）、神经节苷脂（ganglioside，GM）等。鞘脂及其代谢参与调节细胞的生长、分化、衰老和细胞程序性死亡等生命过程［13］。本团队前期在人群试验中已证明H2干预可降低潜在代谢综合征患者［9］和高胆固醇血症［14］的血清 LDL 水平并改善 HDL 功能。但目前尚无H2对磷脂、鞘脂分子具体影响的研究。高脂饲料会导致脂质代谢紊乱，造成血脂升高、脂肪肝、代谢综合征等疾病［15］，也会引起磷脂、鞘脂的代谢紊乱［16］。本研究通过液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）技术对磷脂和鞘脂分子进行靶向脂质组学检测，观察高浓度H2吸入干预对血浆、肝脏主要磷脂、鞘脂分子含量的影响，为深入研究H2对脂质代谢的调节作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物来源与饲料 6 周龄雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，体重240 ～ 260 g，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物使用许可证号：SCXK（京）-2016-0006。大鼠饲养于山东第一医科大学生命科学研究中心动物室，温度（22 ±2）℃，相对湿度为（60± 5）%，12 h 明暗交替，大鼠自由获取食物和水，普通饮食喂养1周后开始实验。本实验经山东第一医科大学实验动物伦理委员会批准（2017049），所有操作均符合动物实验学“3R”原则。

普通饲料和高脂饲料均购买自北京科奥协力饲料有限公司，其中高脂饲料含有24.2%的蛋白质、42.1%的碳水化合物和25.4%的脂肪，分别提供19.8%、35.2%和45%的能量。高脂饲料中进一步添加2%胆固醇及20%果糖。

1.1.2 药品与试剂 PC 14∶0/14∶0、PE 14∶0/14∶0、LPC 19∶0、LPE 14∶0、Cer d18∶1/17∶0、SM d18∶1/17∶0 等标准品购自美国 AvantiPolarLipids 公司；色谱级乙腈、异丙醇、甲基叔丁基醚（MTBE）购自德国Fisher-Chemicals 公司，质谱级乙酸和乙酸铵购自于美国Sigma；其他化学试剂均为分析级；蛋白浓度检测使用Bradford 蛋白浓度测定试剂盒（索莱宝生物科技有限公司，上海）。

1.1.3 主要仪器 液相色谱-质谱（LC-MS/MS）系统由包括岛津公司的高效液相色谱仪（LC-20AD）、脱气机（DGU-20A3）、自动进样器（SIL-20AC）以及ABSCIEX 公司的三重四极杆质谱仪（4000QTrap），并配有PEAK公司的氮气发生器（ABN2ZA）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 大鼠随机分为3 组，每组9 只：（1）对照组（Con组）：使用普通饲料喂养；（2）高脂饮食模型组（HFD组）：使用高脂饲料喂养；（3）H2干预组（HFD+H2组）：使用高脂饲料喂养，同时每天连续吸入浓度为66.7%的H22 h。

1.2.2 H2干预 采用自制的吸氢装置供实验动物吸氢。由H2瓶、O2瓶和空气发生器提供气体，各种气体通过流量计调节流速。气体在塑料箱中混合并供动物呼吸，通过 H2检测器（XP-3140，New Cosmos，日本）检测H2浓度。气体总流速为3 L/min，H2浓度66.7%，O2浓度21.0%。对照组和高脂饮食模型组每天在同样的装置中呼吸空气2 h（空气发生器提供气体）。

1.2.3 样本收集 实验10 周后，各组大鼠麻醉后下腔静脉取血，将含有EDTA 的血液样本于4 ℃3 000 r/min离心15 min，上层血浆在-80 ℃下保存至脂质组学分析使用；大鼠处死后迅速剖取肝脏，取适宜大小的肝组织，置于冻存管中，液氮速冻-80 ℃保存直至分析。

1.2.4 样本前处理

血浆脂质提取：取40 μL血浆样本，加入300 μL含有内标（PC 14∶0/14∶0、PE 14∶0/14∶0、LPC 19∶0、LPE 14∶0、Cer d18∶1/17∶0、SM d18∶1/17∶0）的甲醇，震荡混匀，加入1 mL 的MTBE 混匀，室温下在摇床上震荡1 h；加入 325 μL 纯水，涡旋30 s 后4 ℃静置10 min，然后 10 000 r/min 离心 10 min，取上相 200 μL 氮气吹干，200 μL 乙腈∶丙醇（1∶1，v/v）复溶后检测。

肝脏脂质提取：取大鼠肝组织8 ～10 mg，置于2 mL的离心管中，加入含有内标的甲醇280 μL，于高通量组织研磨器中匀浆1 min。在4 ℃下10 000 r/min离心15 min。取50 μL 上清液，使用考马斯亮蓝（Bradford）法测定蛋白含量（索莱宝科技有限公司，北京）；将MTBE（1 mL）加入剩余肝脏匀浆中，室温下在摇床上震荡1 h；加入325 μL纯水，涡旋30 s后静置 10 min，然后4 ℃、10 000 r/min 离心10 min，取上相200 μL氮气吹干，200 μL乙腈∶丙醇（1∶1，v/v）复溶后检测。

1.2.5 色谱条件 使用Waters Symmetry C18色谱柱（3.5 μm，2.1 mm×100 mm）。流动相A为乙腈/水（60/40，v/v），流动相B 为异丙醇/乙腈（90/10，v/v），同时流动相A、B均添加10 mM乙酸铵及0.1%乙酸。采用5%流动相A、95%流动相B等度洗脱，流速为0.3 mL/min，时间为20 min，柱温40 ℃，进样量为10 μL。

1.2.6 质谱条件 质谱采用电喷雾离子源（ESI）在正离子模式下进行检测。离子喷雾电压和温度分别设定为5 500 V 和400 ℃。雾化气压力55 psi、辅助气压力55 psi、气帘气压力10 psi，碰撞气设置为中等（medium）。所有待分析脂质在多反应监测（MRM）模式下完成定量，定量离子对及去簇电压（DP）、碰撞电压（CE）见表1。

表1 脂质质谱定量检测条件

1.3 数据处理

数据以均数±标准差表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（多重比较使用Duncan法）。检验水准α=0.05。无监督PCA 数据分析采用SIMCA 13.0（Umetrics AB，Umeå，瑞典）软件进行多变量数据分析。脂质的命名和缩写依据 LIPIDMAPS（https：//lipea. biotec. tudresden.de/home）分类系统。

2 结 果

2.1 脂质检测及鉴定

本研究使用靶向脂质组学方法检测了大鼠血浆和肝脏样本中的主要磷脂（PC、PE、LPC、LPE）和鞘脂（Cer、SM）。其中在血浆中检测了19 种PC 分子、5种PE 分子、5种LPC 分子、4种LPE 分子、12种Cer 分子以及 13 种 SM 分子；在肝脏中检测了 25 种PC 分子、13 种 PE 分子、5 种 LPC 分子、10 种 LPE 分子、14种Cer分子以及13种SM分子。

2.2 高脂饮食对磷脂和鞘脂的影响

高脂饮食可以影响脂质代谢，使血浆及肝脏中的磷脂、鞘脂谱发生显著变化。首先，本研究比较了对照组与高脂饮食模型组血浆样本和肝脏组织样本中脂质谱的差异。通过无监督主成分分析（PCA）可以看出，高脂饮食模型组大鼠和对照组相比，血浆样本（图1A）和肝脏组织样本（图1B）中的磷脂、鞘脂成分有较大差异。两组大鼠肝脏脂质差异更大。

图1 普通饮食和高脂饮食大鼠血浆和肝脏组织中磷脂和鞘脂主成分（PCA）分析

本研究进一步分析了高脂饮食模型组大鼠与对照组大鼠血浆和肝脏中不同脂质分子的变化。在血浆中差异脂质分子共计33 种，其中7 种PC 分子上调，包括PC 16∶0/16∶1，PC 16∶1/18∶1，PC 16∶0/18∶1，PC 16∶0/20∶3，PC 18∶1/18∶1，PC 18∶0/18∶1，PC 18∶0/20∶3；7 种PC 分子下调，包括PC 16∶0/16∶0，PC 16∶0/18∶2，PC 18∶2/18∶2，PC 16∶0/20∶4，PC 18∶1/20∶4，PC 18∶0/20∶4，PC 18∶0/22∶6；3 种 PE 分子均上调，包括PE 16∶0/18∶2，PE 16∶0/20∶4，PE 18∶0/20∶4；7 种Cer 分子下调，包括 Cer d18∶1/14∶0，Cer d18∶1/16∶1，Cer d18∶1/16∶0，Cer d18∶1/22∶1，Cer d18∶1/22∶0，Cer d18∶1/24∶0，Cer d18∶1/26∶0；9 种SM 分子含量下调，包括SM d18∶1/14∶0，SM d18∶1/16∶0，SM d18∶1/18∶2，SM d18∶1/20∶1，SM d18∶1/22∶1，SM d18∶1/22∶0，SM d18∶1/24∶0，SM d18∶1/26∶1，SM d18∶1/26∶0（图2A）。

图2 普通饮食和高脂饮食大鼠血浆和肝脏组织的脂质检测热图

在肝脏中差异脂质分子共计68 种，其中24 种PC 分子均上调，包括PC 16∶0/16∶1，PC 16∶0/16∶0，PC 16∶1/18∶2，PC 16∶0/18∶2，PC 16∶0/18∶0，PC 18∶0/18∶0，PC 16∶0/20∶2，PC 6∶1/18∶1，PC 16∶0/18∶1，PC 16∶0/20∶5，PC 18∶2/18∶2，PC 16∶0/20∶4，PC 18∶1/18∶2，PC 18∶1/18∶1，PC 18∶0/18∶2，PC 18∶0/18∶1，PC 18∶2/20∶4，PC 16∶0/22∶6，PC18∶1/20∶4，PC 18∶0/20∶4，PC 18∶0/20∶3，PC 18∶1/22∶6，PC 18∶0/22∶6，PC 18∶0/20∶6；13 种PE 分子均上调，包括PE 16∶0/18∶2，PE 16∶0/20∶4，PE 16∶0/20∶2，PE 18∶0/18∶2，PE 18∶2/22∶5，PE 16∶0/22∶6，PE 18∶0/20∶4，PE 18∶0/20∶3，PE 18∶0/22∶6，PE 18∶0/22∶5，PE 18∶0/22∶4，PE 20∶0/20∶4，PE18∶0/20∶6；3 种 LPC 分子均上调，包括 LPC 18∶0，LPC 20∶4，LPC 18∶2 ；10 种 LPE 分子均上调，包括 LPE 16∶0，LPE 18∶0，LPE 18∶1，LPE 20∶4，LPE 18∶2，LPE 22∶4，LPE 22∶6，LPE 16∶1，LPE 20∶1，LPE 20∶3；10 种 Cer 分子上调，包括Cer d18∶1/16∶1，Cer d18∶1/16∶0，Cer d18∶1/18∶1，Cer d18∶1/18∶0，Cer d18∶1/20∶4，Cer d18∶1/22∶0，Cer d18∶1/24∶1，Cer d18∶1/24∶0，Cer d18∶1/26∶1，Cer d18∶1/26∶0；Cer d18∶1/20∶0 分子下调；6 种 SM分子上调，包括SM d18∶1/16∶0，SM d18∶1/18∶1，SM d18∶1/18∶0，SM d18∶1/20∶0，SM d18∶1/22∶0，SM d18∶1/24∶1；SM d18∶1/18∶2分子下调（图2B）。

2.3 66.7%H2干预对血浆磷脂和鞘脂分子的影响

与高脂饮食模型组相比，66.7%H2干预可以显著影响多种磷脂和鞘脂分子。在血浆中66.7%H2干预后改变的磷脂分子有7 种和鞘脂分子1 种，分别属于 PC、LPE 和 SM 脂质亚类，包括 PC 16∶0/18∶0，PC 16∶1/18∶1，PC 18∶2/18∶2，PC 18∶1/18∶2，PC 18∶1/18∶1，LPE 16∶0，LPE 18∶1，LPE 20∶4，SM d18∶1/18∶2，这些分子在H2干预后均下调，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表2。

表2 H2干预对血浆脂质分子的影响

2.4 66.7%H2干预对肝脏磷脂和鞘脂分子的影响

本研究同样靶向检测了肝脏组织中的磷脂和鞘脂分子，发现66.7%H2干预后对肝脏磷脂影响较大，而对Cer、SM 等鞘脂无影响。共计25 种磷脂分子含量显著下调，分别属于PC、PE、LPC和LPE脂质亚类，包括：PC 16∶0/18∶2，PC 16∶0/18∶0，PC 18∶0/18∶0，PC 16∶0/20∶2，PC 16∶1/18∶1，PC 16∶0/18∶1，PC 16∶0/20∶5，PC 16∶0/20∶4，PC 18∶1/18∶1，PC 18∶0/18∶1，PC 16∶0/22∶6，PC 18∶1/20∶4，PE 18∶0/18∶2，PE 18∶2/22∶5，PE 18∶0/22∶5，PE 18∶0/22∶4，PE 20∶0/20∶4，PE 18∶0/20∶6，LPC 18∶0，LPC 20∶1，LPC 22∶6，LPE 16∶0，LPE 18∶0，LPE 18∶1，LPE 20∶1（表3）。

表3 H2干预对肝脏脂质分子的影响

3 讨 论

H2是无色无味且分子量最小的气体。自1975年Dole等［1］首次提出H2可用于治疗疾病的概念后，H2已经被验证对包括神经［17］、心血管［18］、呼吸［6］、消化和皮肤等系统和组织在内的170多种疾病具有一定的疗效［19］。其机制涉及到抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡以及对线粒体和内质网的保护、调节细胞内信号通路和平衡免疫细胞亚型等作用。2020年，H2应用于医疗健康领域取得重要突破，氢氧雾化机作为三类医疗器械获国家药监局批准上市，标志着氢医学正式进入临床应用。

脂质代谢异常可以引起高脂血症、脂肪肝、AS 等疾病，血液和肝脏组织中胆固醇酯、甘油酯、鞘磷脂等脂质稳态的变化是非酒精性脂肪肝的重要特征。研究表明，健康受试者和非酒精性脂肪肝患者之间的血脂谱存在显著差异［20］。磷脂作为脂蛋白中的关键部分，其含量和成分的改变，对代谢性疾病的发生也至关重要［21］。本实验通过对比正常饲料的对照组和高脂饮食饲养的模型组大鼠，证实了高脂饮食对血浆和肝脏磷脂、鞘脂谱的影响。通过靶向脂质组学的检测发现，与对照组相比，高脂饮食会造成大鼠血浆19 种PC 分子中14 种发生显著改变，其中 7 种上调，7 种下调；5 种PE 分子中3 种改变且均上调；在肝脏中，25 种PC分子中有24 种含量上调，13 种PE 分子含量全部上调，5种LPC分子中3种分子含量上调，10种LPE分子上调。由此可见，高脂饮食显著影响了甘油磷脂代谢相关通路。

作为含量仅次于磷脂的鞘脂，其代谢途径的主要成分在心血管疾病、肥胖症、糖尿病、胰岛素抵抗和非酒精性脂肪肝疾病中也同样发挥着重要作用［16，22］。Cer 是鞘脂生物学的核心生物分子，调节关键的细胞膜特性、信号转导、细胞的增殖和凋亡，在Cer 分子水平进行分子调控，进行靶向药物干预治疗在近几年已经较为成熟［23］。SM代谢异常与AS有关［24］。本研究发现，高脂饮食会造成大鼠血浆12种 Cer 分子中 7 种下调，13 种 SM 分子 9 种下调。肝脏中 11 种 Cer 分子 10 种上调，1 种下调；7 种 SM 分子6种上调，1种下调。由此可见，高脂饮食对鞘脂代谢相关通路也有较大影响。

高脂饮食诱导的脂质代谢紊乱可导致多种代谢性疾病的发生［19］，H2可能是代谢性疾病干预的一个重要辅助手段。目前研究已表明H2可改善血脂，如降低甘油三酯、胆固醇等［25］。但是尚未有在磷脂和鞘脂分子层面的分析。本研究证实，H2干预高脂饮食大鼠，其血浆中19种PC分子中下调5种，4 种 LPE 分子中下调 2 种，13 种 SM 中下调 1 种；肝脏中 25 种 PC 分子 12 种下调，13 种 PE 分子中 6 种下调，5 种 LPC 分子中 3 种下调，10 种 LPE 分子中4 种下调。H2可以降低肝脏脂质堆积，减少炎症细胞因子水平［26］。本团队前期的研究证明，H2的吸入对减轻肝脏脂质堆积有计量依赖性的作用，高剂量的H2吸入对减少肝脏的脂质堆积有显著作用［8］。本研究通过靶向脂质组学的方法，进一步验证了H2可以影响肝脏磷脂和鞘脂的代谢，H2干预可改善高脂饮食导致的血浆、肝脏中多种磷脂、鞘脂分子水平的异常。

综上所述，本研究在高脂饮食导致的磷脂和鞘脂代谢紊乱大鼠中，证明了66.7%的H2吸入可对其血浆、肝脏中的多种磷脂、鞘脂分子产生显著影响。H2可作为一种改善脂质代谢的有效辅助手段。H2改善脂质代谢的分子机制值得进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突