柚皮素与卡马西平共晶的红外光谱与拉曼光谱分析*

冀威文，周健，谢逸菲，张宝喜，杨世颖，吕扬

(北京协和医学院、中国医学科学院药物研究所晶型药物研究北京市重点实验室，北京 100050)

药物共晶是由药物活性成分(active pharmaceutical ingredient，API)和共晶形成物(cocrystal former，CCF)以氢键或其他非共价键结合形成的固态晶体[1]。与固体药物的其他形态一样(多晶型、盐、水合物或溶剂化物)，共晶的形成能有效改善药物的理化性质、生物利用度、稳定性和加工性能[1-2]。此外，药物共晶还能产生药理协同或互补作用，这也为共晶药物的研发赋予了更大的前景与潜力。

确证共晶形成的关键是证实API与CCF分子间形成了非共价相互作用(氢键、π-π共轭作用等)，最准确的技术手段是单晶X射线衍射法，但该方法前提是必须获得适合衍射实验用的单晶体，且对晶体的尺寸、结晶度和完整度都有较高要求，因此，对于不易结晶的共晶物质成为制约其确证表征的难题[3]。红外光谱(infrared spectroscopy，IR)和拉曼光谱(Raman)等光谱技术由于能够探知官能团的分子作用力变化，在药物共晶研究中应用越来越广泛。两种光谱技术原理不同，形成有力互补，同时两种光谱技术还具有对样品无损伤、测试简单快速等优点[4]。目前，红外光谱和拉曼光谱均属于《中华人民共和国药典》2020年版四部9015药品晶型研究及晶型质量控制指导原则中收载的用于晶型与共晶研究的检测分析技术方法。傅里叶变换红外光谱法(Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR)是依据分子内部原子间相互振动以及分子转动等信息来推测被测物分子结构的一类分析方法[5]，已被各国药典收载用于药物晶型的检测分析。张慧丽等[6]用固体研磨的方法制备由吡拉西坦和3-羟基苯甲酸作为原料药的药物共晶体，红外光谱、拉曼光谱和太赫兹光谱(THz)表征结果均表明共晶体的振动模式与原料药有显著区别；拉曼光谱则由分子极化率变化产生[7]，在红外光谱中难以反映的振动在拉曼光谱中很强，故红外光谱和拉曼光谱常常联合应用于晶型样品的定性分析[8]。王琪琪等[9]研究发现拉曼光谱技术可以有效鉴别吡嗪酰胺、2，5-双羟基苯甲酸及其共晶体，并证明共晶之间存在的相互作用和其内部晶格振动改变导致一系列图谱的峰数量或峰裂分、峰位置以及峰强度或峰形拓扑等方面产生了变化。

柚皮素属二氢黄酮类化合物，因其具有抗炎[10]、抗肿瘤[11]、抗焦虑[12]、降血脂[13]以及抗纤维化[14]等作用，被广泛关注并应用于医药、食品等领域；卡马西平属二苯并氮杂类抗癫痫药，临床上被应用于缓解耳鸣或三叉神经痛，预防或治疗躁狂症或抑郁症[15]。二者若能形成共晶，不仅可能改善溶解性，还有可能产生药理协同作用。2019年LEE等[16]获得了柚皮素与卡马西平共晶，并采用单晶X射线衍射法、粉末X射线衍射法(powder X-ray diffraction，PXRD)、差示扫描量热法、热重分析法对该共晶进行了表征，但未开展柚皮素与卡马西平共晶物的光谱分析研究。

笔者采用红外光谱和拉曼光谱系统分析了柚皮素与卡马西平共晶物、柚皮素、卡马西平三者之间的光谱特征与区别差异，重点对柚皮素与卡马西平共晶物的分子间作用力进行研究，从不同角度探究其共晶的形成机制。

1 材料与方法

1.1仪器 D/max2550粉末X射线衍射仪(日本Rigaku公司)；Horiba HR evolution高分辨拉曼光谱仪 (法国HORIBA公司)；Spectrum 400型傅里叶变换红外光谱仪(美国PerkinElmer公司)。

1.2试药 柚皮素(陕西惠科植物开发有限公司，含量：98.0%，批号：20190703)；卡马西平(武汉远成共创科技有限公司，含量：100.3%，批号：20190329)；乙酸乙酯(福晨化学时间有限公司，AR级，批号：20190804)。

1.3共晶样品制备 按照摩尔比1：1分别称取柚皮素、卡马西平的原料药13.6，11.8 mg，置于晶体生长管中，加入乙酸乙酯200 μL，放入转子，置于磁力搅拌器400 r·min-1，搅拌48 h，之后将其放入40 ℃真空干燥箱内干燥12 h，即得柚皮素与卡马西平共晶，对所得样品进行PXRD分析，将PXRD实验图谱与理论图谱进行比对，确证共晶物的形成。

1.4共晶样品表征 PXRD测试条件为：Cu 靶，电压40 kV，电流40 mA，测试角度范围3°～40°，取样品适量分别进行PXRD分析；红外光谱分析采用傅里叶变换红外光谱仪，仪器分辨率为4 cm-1，扫描次数16次，压力值80 Pa；拉曼光谱分析采用拉曼光谱仪，使用激光光源波长为633 nm，光栅600 gr·mm-1，累积时间3 s，累计次数3次。

2 结果

2.1柚皮素与卡马西平共晶的确证分析 柚皮素、卡马西平、柚皮素与卡马西平共晶的粉末图谱见图1。对比可见，共晶与API和CCF粉末衍射图谱中特征峰发生明显改变，峰位以及峰形完全不同。共晶化合物在2θ=5.46°，6.80°，16.52°，18.24°，24.42°出现了新的衍射峰，柚皮素11.52°，15.84°和卡马西平10.10°，15.39°的特征峰消失。PXRD图谱结果提示，柚皮素和卡马西平之间形成了新的共晶物。共晶物的实验PXRD图谱与已获得单晶的理论PXRD图谱比对一致，证明获得的实验样品为晶型纯度较高的柚皮素与卡马西平共晶物。

图1 理论共晶(A)、实验共晶(B)、卡马西平(C)和柚皮素(D)的PXRD图谱 Fig.1 Powder X-ray diffraction patterns of theoretical cocrystal (A)，experimental cocrystal (B)，carbamazepine (C) and naringin (D)

2.2柚皮素与卡马西平共晶的红外光谱分析 柚皮素、卡马西平、柚皮素与卡马西平共晶物的红外光谱叠合图见图2。对比三者的红外特征峰可发现，共晶的各个吸收峰都产生了不同程度的位移现象，本文主要针对波数在3500～3000 cm-1的氢原子的伸缩振动和波数在1700～700 cm-1的羰基的伸缩振动和氢原子弯曲振动进行研究，氢键的形成可使分子中的X-H键(X=C、N、O)的振动频率改变，由于分子的缔合，使电子云密度平均化，从而使氢原子的伸缩振动频率降低且峰变宽，对于氢原子的弯曲振动，则会产生相反的效果。

图2 共晶(A)、卡马西平(B)和柚皮素(C)的红外光谱图Fig.2 Infrared spectra of cocrystal (A)，carbamazepine (B) and naringin (C)

卡马西平红外光谱中归属为N-H伸缩振动峰位于3464 cm-1处，在共晶中该特征吸收峰向低频方向位移至3420 cm-1处，图谱中卡马西平归属为N-H弯曲振动峰位于1593 cm-1处，在共晶中的特征吸收峰向高频方向移至1646 cm-1处，且卡马西平在1677，1604 cm-1的νC=O-R、νC=O伸缩振动峰在共晶中的特征吸收峰向1675 cm-1处移动。另外，卡马西平的γN-H吸收峰原本在762 cm-1处，因氢键的作用向高频段806 cm-1处移动，说明卡马西平的C=O和-NH2共同参与了共晶的形成。柚皮素红外光谱中归属为O-H伸缩振动峰位于3267 cm-1处，由于共晶中氢键的作用使其特征吸收峰向低频方向位移至3199 cm-1，且图谱中柚皮素归属为O-H弯曲振动峰位于1246，1153 cm-1处，在共晶中的特征吸收峰向高频方向移至1421cm-1处，说明参与形成氢键的基团应该是-OH。卡马西平和柚皮素中都存在羰基的伸缩振动峰，但分析发现只有卡马西平的νC=O峰由于氢键影响从1675 cm-1向低频1677 cm-1移动，共晶中归属为NAR的νC=O峰则与其本身的峰位置基本一致，表明柚皮素的C=O键中的振动峰从1599 cm-1向低频1600 cm-1移动，没有明显参与共晶氢键的形成(表1)。综上所述，由红外吸收光谱推测分析可知，柚皮素和卡马西平之间由于 OH…O、NH…O相互作用，形成共晶。

表1 柚皮素、卡马西平和柚皮素与卡马西平共晶的红外光谱特征 Tab.1 Infrared spectral characteristics of naringin，carbamazepine and their cocrystal cm-1

2.3柚皮素与卡马西平共晶的拉曼光谱分析 柚皮素、卡马西平、柚皮素与卡马西平共晶物的拉曼光谱见图3。对照可以发现，柚皮素与卡马西平共晶分子的拉曼特征峰相较原料药的拉曼特征峰有了明显的拉曼位移，原料药的一些特征峰出现了减弱乃至消失的变化。对比共晶，值得关注的是1000～800 cm-1波数范围内的变化，此范围被定义为芳环的骨架振动、CH变形和环变形波段[17]，柚皮素原料药的拉曼特征峰为712.19 cm-1，卡马西平原料药的拉曼特征峰为698.22 和723.20 cm-1，成共晶后特征峰发现该处并没有明显的拉曼信号，这表明共晶中的苯环周围可能存在如π-π堆积的弱相互作用[18]。拉曼图谱的1800～1400 cm-1波数范围归属为羰基和酰胺基团吸收，柚皮素原料药的νC=O振动峰在1588.01 和1618.79 cm-1处，卡马西平原料药的酰胺谱带有1564.78 cm-1(δCN)、1600.02 cm-1(δNH)和1622.53 cm-1(νC=O)处，在共晶中的特征吸收峰由于氢键的形成向低频方向移至1561.62，1597.51 和1619.42 cm-1。总体来说拉曼光谱在对比内部结构和分子振动方面更侧重于非极性基团的分析，特别是苯环振动区有明显变化，从而更加全面地探索了柚皮素与卡马西平共晶的形成机制。

图3 共晶(A)、卡马西平(B)、柚皮素(C)的拉曼图谱 Fig.3 Raman spectra of cocrystal (A)，Carbamazepine (B) and Naringin (C)

根据柚皮素与卡马西平共晶的单晶X射线衍射分析结果[16]，卡马西平分子的酰胺基团扮演着供体和受体角色，它与两个柚皮素分子形成两种不同的氢键，柚皮素间苯二酚基团与两个卡马西平分子的-NH2形成氢键，与本文得出红外图谱中共晶对比柚皮素的-OH特征峰和CBZ的-NH2特征峰产生偏移，拉曼图谱中共晶对比原料药苯环振动区和酰胺谱带变化的结果一致，表明两种光谱有鉴别分析和阐明氢键形成机制的能力。

3 讨论

柚皮素分子结构为黄酮母核，在5位、7位和4′位含有3个酚羟基，4位羰基常与5位酚羟基形成分子内氢键，其与7位、4′位酚羟基均是形成超分子化合物的活性基团。从柚皮素目前已报道的共晶物[16，19-22]来看，柚皮素可通过7位酚羟基、4位羰基和苯环上4′位酚羟基与含有酰胺、脲、胺、吡啶或羰基的CCF形成氢键，氢键是超分子化学的主要作用力之一。卡马西平是两个苯环并氮杂的酰胺类化合物，既充当氢键受体又能充当氢键供体。不同的官能团和化学键的红外与拉曼频率具有其特征，这些官能团和化学键的特征频率在共晶形成的过程中由于分子间的作用力(主要表现为氢键的作用)的变化，常常也会发生不同程度的偏移[8，23]。红外光谱与拉曼光谱均属于振动光谱，红外光谱源于分子偶极距变化，对分子中的极性基团常常具有较强的吸收；而拉曼光谱则由分子极化率变化产生，对分子中的非极性基团具有更好的特征性，两种光谱相互补充，从不同角度展示了共晶物分子结构的振动信息及分子作用力的变化，为探求共晶形成机制提供了有效的技术手段。

笔者采用红外光谱和拉曼光谱相结合的分析方法，对悬浮液法制备所得的柚皮素与卡马西平共晶进行表征，并对不同物相体系中分子的特征峰振动模式进行归属。红外光谱分析结果表明，柚皮素与卡马西平共晶中特征基团的红外吸收峰，如-OH伸缩振动峰和-C-N伸缩振动峰等，较柚皮素和卡马西平而言均发生了较大波数的峰位偏移，同时伴随着峰宽和峰强度的变化；拉曼光谱分析结果也显示柚皮素和卡马西平共晶中，二者分子之间存在氢键、π-π堆积等相互作用力，光谱分析的结果与单晶X射线衍射分析结果一致，从而佐证了共晶物两种组分间的分子作用方式以及共晶形成机制。可见，对于难以获得单晶结构的共晶物，使用红外光谱与拉曼光谱相结合的方法可以进行共晶分子作用力的分析，并能够显示出一定的技术优势。在药物共晶研究过程中，通过多种不同原理的分析技术，可以从不同角度进行表征分析，为阐明共晶形成机制与特点提供较全面的、多维度的科学依据。