芒柄花素-4，4’-联吡啶共晶的制备表征及溶解性能*

房政钰，王雪，邢逞，龚宁波，吕扬

(北京协和医学院、中国医学科学院药物研究所晶型药物研究北京市重点实验室，北京 100050)

芒柄花素又称刺芒柄花素、芒柄花黄素、7-羟基-4’-甲氧基异黄酮，属于异黄酮类化合物，广泛存在于黄芪、甘草和葛根等豆科植物中，具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、降血脂、调节激素等多种药理作用[1-7]，可作为化疗药佐剂用于癌症治疗并缓解化学治疗所致的神经毒性[8]，可调节血压、血脂，用于预防和治疗心血管疾病[9]。芒柄花素水溶性差、不易吸收、生物利用度低，当前人们常通过化学衍生化或制备其纳米制剂提高药效[9-11]。

药物的固体存在状态可直接影响药物的理化性质、生物利用度、安全性和有效性，其种类主要有无定型态、单组分多晶型、水合物、溶剂化物、盐和共晶[12]。药物共晶是一种新型药物固体状态，它通过共晶中不同组分间的非共价相互作用形成多组分化合物，在共晶形成过程中不会破坏分子原有的共价键，但可通过共晶技术改善药物的稳定性、溶解性、生物利用度[13-14]。共晶制备方法包括溶剂挥发法、研磨法、悬浮液法、升华法和融化法等，其制备方法大多简单易行，实验周期短，易于在工业制药中推广[15]。前期文献调研中笔者未见芒柄花素共晶的报道，本研究通过共晶技术改善芒柄花素的溶解度，选择4，4’-联吡啶作为配体通过悬浮液法和加液研磨法与芒柄花素形成共晶，利用核磁共振波谱法(nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)、粉末X射线衍射法(powder X-ray diffraction，PXRD)、红外光谱法(infrared spectroscopy，IR)、差示扫描量热法(differential scanning calorimetry，DSC)对其进行表征，分析分子间相互作用，为揭示芒柄花素共晶的形成机制提供了技术支撑。溶解性和稳定性实验结果显示，在0.5%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)溶液中芒柄花素-4，4’-联吡啶共晶的溶解度有所提高，且共晶在高温、高湿和光照下均保持稳定，为进一步开发芒柄花素共晶药物奠定基础。

1 仪器与试药

1.1仪器 Rigaku D/max-2550粉末X射线衍射仪(日本理学Rigaku公司)；DSC1型差示扫描量热仪(瑞士Mettler Toledo公司)；Spectrum 400型傅里叶变换红外光谱仪(美国PerkinElmer公司)；XS105 Dual Range型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司，感量：0.01 mg)；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司)；DZF-6020型真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)；RC12AD型溶出实验仪(TDTF天大天发有限公司，配RZQ-12D取样收集系统)；Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司，配DAD检测器)；Bruker AVANCE III-500超导傅里叶变化核磁共振波谱仪(500 M，瑞士Bruker公司)。

1.2试药 芒柄花素：南京特拉维斯生物科技有限公司，含量>98.0%；4，4’-联吡啶：九鼎化学有限公司，含量>98%；实验中使用的溶剂均为分析纯，实验用水为纯净水。

2 方法与结果

2.1共晶制备 取芒柄花素原料药268 mg，4，4’-联吡啶原料药156 mg置于洁净的锥形瓶内，加入乙醇5 mL于室温(25 ℃)转速300 r·min-1条件下搅拌12 h，滤过取滤饼；或取芒柄花素原料药268 mg，4，4’-联吡啶原料药156 mg置于洁净的研钵，加入乙醇5 mL于室温中研磨30 min，60 ℃条件下减压干燥24 h得粉末即为芒柄花素-4，4’-联吡啶共晶。

2.2共晶表征

2.2.1NMR分析共晶表征 NMR波谱分析是利用NMR对物质进行定性、定量分析和结构测定一种方法，它可以提供共晶结构中氢原子和碳原子的数目，确定活性药物成分和配体比例，分析分子结构和分子间作用力，为共晶的形成提供有力依据[16]。取芒柄花素-4，4’-联吡啶共晶10 mg溶于二甲亚砜(DMSO)-d6溶剂中，温度为24.85 ℃(298 K)，进行核磁共振氢谱和碳谱测定。

芒柄花素-4，4’-联吡啶共晶的1H-NMR谱见图1。1H-NMR(500 MHz，DMSO) δ 10.83(1H，s，7-OH)，8.35(1H，s，2-H)，7.98(1H，d，J=8.8 Hz，5-H)，7.51(2H，d，J=8.8 Hz，2’，6’-H)，6.99(2H，d，J=8.8 Hz，3’，5’-H)，6.95(1H，dd，J=8.8，2.3 Hz，6-H)，6.88(1H，d，J=2.3 Hz，8-H)，3.79(3H，s，7’-H)归属为芒柄花素中H原子的化学位移信号，8.73(2H，dd，J=4.5，1.6 Hz)和7.84(2H，dd，J=4.5，1.6 Hz)分别归属为4，4’-联吡啶中的邻位氢和间位氢的特征峰。对比文献可知芒柄花素在形成共晶后7-OH的化学位移向低场移动[17]，可能与形成共晶时7-OH形成分子间氢键有关。共晶的13C-NMR谱如图1所示，13C-NMR(126 MHz，DMSO) δ 175.12(C=O)，163.08(C-7)，159.45(C-4’)，157.96(C-9)，153.70(C-2)，130.60(C-2’，C-6’)，127.83(C-5)，124.74(C-1’)，123.65(C-3)，117.12(C-10)，115.70(C-6)，114.10(C-3’，C-5’)，102.64(C-8)，55.65(C-7’)归属为芒柄花素特征峰，151.09，144.82和121.81归属为4，4’-联吡啶特征峰。通过1H-NMR和13C-NMR谱分析可知，该共晶中含有芒柄花素和4，4’-联吡啶[17-19]。

图1 芒柄花素-4，4’-联吡啶共晶1H-NMR和13C-NMR图谱 Fig.1 1H-NMR and 13C-NMR spectra of formononetin-4，4'-bipyridine cocrystal

2.2.2PXRD共晶表征 PXRD分析是通过多晶粉末对X射线衍射分析晶体结构的一种方法，粉末衍射图谱被认为是晶态样品的指纹图谱，当衍射峰的位置、强度和形状发生变化时，证明有新晶相的形成，可用于共晶的鉴别[20]。取等量芒柄花素、4，4’-联吡啶原料药以及共晶(约50 mg)，研磨成细粉状，上机测试PXRD图谱。测试条件为：CuKα，λ=1.54178 Å，管压40 kV、管流150 mA，2θ扫描范围为3°～ 40°，步长0.02°，扫描速度为8°·min-1。

PXRD图谱见图2。芒柄花素位于7.46°，9.84°，14.90°，16.22°，24.44°，25.18°，30.02°，30.74°和32.78°处衍射峰消失；4，4’-联吡啶位于10.34°，12.38°，13.38°，17.78°，18.52°，19.54°，21.72°，22.56°，24.94°，25.28°和25.86°处的衍射峰消失；而芒柄花素-4，4’-联吡啶在7.32°，8.98°，16.10°，18.90°，20.44°，21.24°和23.68°处有新衍射峰出现，上述共晶的PXRD图谱中衍射峰的位置、强度和形状相较于原料药均发生变化，证明新的物相形成。

图2 芒柄花素、4，4’-联吡啶及共晶PXRD图谱 Fig.2 PXRD patterns of formononetin，4，4'-bipyridine and their cocrystal

2.2.3IR分析法共晶表征 IR是依据分子振动能级与转动能级跃迁引起的吸收光谱，在形成药物共晶时，原料药中氢键等分子间作用力发生变化，会引起分子振动能级与转动能级的改变，致使红外特征吸收峰的强度、位置发生改变，因此可通过IR分析共晶中的分子间作用力，辅助判断共晶的形成[21]。分别称取芒柄花素、4，4’-联吡啶原料药以及共晶样品适量，采用衰减全反射法进行IR分析检测，扫描次数16次，4000～ 650 cm-1全谱扫描，记录红外谱图。

IR分析结果见图3。芒柄花素-4，4’-联吡啶共晶在3091，3053，2931，1620，1598，1538，808，731 cm-1产生红外吸收峰，其中3053 cm-1归属于不饱和碳的νC-H，2931和1620 cm-1分别归属于芒柄花素中甲基碳的νC-H和νC=O，1598和1538 cm-1的吸收峰归属于νC=C和νC=N，位于808和731 cm-1的吸收峰归属于芳香环δAr-H。由IR分析可知，共晶由芒柄花素及4，4’-联吡啶两部分组成，且与芒柄花素、4，4’-联吡啶IR图谱比较，共晶的IR图谱在官能团特征区νO-H(2800～3600 cm-1)发生变化，芒柄花素中νO-H=3126 cm-1，在形成共晶时νO-H红移与不饱和碳的νC-H在3053 cm-1附近一起形成吸收峰，可能是芒柄花素中的O-H与4，4’-联吡啶中两端的N原子形成氢键所致，因此芒柄花素与4，4’-联吡啶之间可能通过C=N…H-O的相互作用形成共晶，红外吸收光谱分析佐证芒柄花素、4，4’-联吡啶形成了新的物质，可作为共晶鉴别的辅助手段。

图3 芒柄花素、4，4’-联吡啶及共晶IR图谱 Fig.3 IR spectra of formononetin，4，4'-bipyridine and their cocrystal

2.2.4DSC共晶表征 DSC分析是一种热分析技术，通过研究样品在程序控温下的热力学行为，可判断样品中是否含有结晶溶剂，在药物共晶的鉴别、纯度检验、熔点测定等方面发挥着不可替代的作用[22]。分别称取芒柄花素、4，4’-联吡啶原料药以及共晶样品约2 mg，置于带盖铝坩埚中，以空铝坩埚作为参比，N2气氛50 mL·min-1，扫描范围：30～350 ℃，升温速率：10 ℃·min-1，记录吸热曲线，采用STARe数据处理软件处理图谱。

DSC图谱见图4。芒柄花素的熔点为267.00 ℃，4，4’-联吡啶的熔点和沸点为112.25和296.18 ℃，芒柄花素-4，4’-联吡啶共晶在上述温度下未产生吸热峰，表明所形成的共晶纯度较高没有原料药剩余，且在202.20 ℃处产生不同于原料药的新吸热峰，表明有新晶相形成。芒柄花素-4，4’-联吡啶共晶熔点在202.20 ℃，所形成的共晶熔点低于芒柄花素原料药，因此可通过形成药物共晶降低药物熔点，改变药物的稳定性和溶解性。

图4 芒柄花素、4，4’-联吡啶及共晶DSC图谱 Fig.4 DSC spectra of formononetin，4，4'-bipyridine and their cocrystal

2.2.5溶解度实验 分别称取过孔径0.15 mm(100目)药筛的30 mg芒柄花素当量的原料药和共晶，分别加入溶出介质450 mL(0.5% SDS缓冲溶液)于溶出实验仪，采用桨法，温度37 ℃，转速100 r·min-1，分别5，15，30，60，90，120，180，240，360和480 min取样，用孔径0.22 μm滤膜滤过，续滤液用高效液相色谱法分析测定样品的溶解性能。色谱条件[23]：Welch Ultimate AQ-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈和0.2%磷酸溶液梯度洗脱10 min(0 min，30%乙腈：70%磷酸溶液，10 min，60%乙腈：40%磷酸溶液)，后运行5 min，流速：1.0 mL·min-1，检测波长为272 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。平行重复3次实验。

利用高效液相色谱法对样品溶解含量进行检测，以时间为横坐标，溶出浓度为纵坐标绘制溶出曲线，计算溶出曲线的相似因子f2值。芒柄花素原料药及共晶在0.5% SDS缓冲液中的溶解度结果见图5。在0.5% SDS缓冲液中，芒柄花素原料药的平衡溶解度(13.5±0.4) μg·mL-1，芒柄花素-4，4’-联吡啶的平衡溶解度为(35.2±1.7) μg·mL-1，共晶相比于芒柄花素原料药溶解度提高了2.61倍，f2=37，f2<50，可见芒柄花素在形成共晶时溶解度有明显改善，因此芒柄花素可通过与4，4’-联吡啶形成共晶提升其溶解度。

图5 芒柄花素和芒柄花素-4，4’-联吡啶共晶的溶出曲线 Fig.5 Dissolution profiles of formononetin and formononetin-4，4'-bipyridine cocrystal

2.2.6稳定性实验 称取芒柄花素-4，4’-联吡啶共晶样品100 mg分别放置于敞口的培养皿中，按稳定性重点考察项目进行检测，并于第0天、第5天和第10天取样50 mg，利用PXRD方法对不同时间点的晶型状态进行分析。实验条件：高温实验条件为(60±1) ℃温度下放置0，5，10 d；高湿实验条件为置于恒湿密闭容器中，在25 ℃温度下相对湿度(90±5)%条件下放置0，5，10 d；光照实验条件为放在光照箱内，于25 ℃下照度为(4500±500)lx的条件下放置0，5，10 d 。结果芒柄花素-4，4’-联吡啶共晶在高温、高湿及光照条件下均保持稳定。

3 讨论

芒柄花素是一种异黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、降血脂、调节激素等多种药理作用，但较差的溶解性导致其生物利用度低，限制临床应用。为改善其溶解度从而提高生物利用度，本研究采用悬浮液法和加液研磨法制备获得了一种全新的芒柄花素-4，4’-联吡啶共晶。表征分析发现该共晶具有特征的NMR图谱、PXRD图谱、IR图谱和DSC特征吸热峰，确证了新共晶物质的生成。通过平衡溶解度实验评价其溶解度，发现在0.5%SDS条件下该共晶可显著提高原料药溶解性，通过考察稳定性重点项目，发现该共晶在高温、高湿和光照下均保持稳定。因此，本研究获得的芒柄花素-4，4’-联吡啶共晶稳定性良好，其溶解性明显优于原料药，具有提高芒柄花素生物利用度的潜力，生物活性实验及晶体生长在进一步的研究中，本实验为共晶技术在改善药物溶解性方面提供了应用基础数据。