血清lncRNA HOTAIR在肝癌患者中的表达及临床诊断意义*

原发性肝癌(PLC)是全球发病率第5位癌症，其致死率在肿瘤相关死亡病例中位居第3

。肝癌起病隐匿，进展迅速，许多患者在诊断时已失去手术机会，病死率高，早期诊断成为提高PLC患者生存率的关键

。lncRNA在多种肿瘤组织和体液(如血液、唾液和尿液等)中存在异常表达，且已应用于部分肿瘤的早期诊断

，可较早地预测疾病的复发和转移，在疾病的诊治中至关重要。lncRNA HOTAIR在肝癌中的过度表达与其不良预后、肿瘤进展和复发呈正相关

，可能是肝癌诊断潜在的敏感性指标。因此，为验证lncRNA HOTAIR在肝癌患者中的表达及评估诊断价值意义，我们开展了本项研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2019年4月至2019年11月就诊于杭州市西溪医院的PLC患者61例，男50例，女11例，年龄23～84(55.96±12.34)岁。另选取年龄、性别匹配的肝硬化患者20例，男14例，女6例，年龄21～80(53.11±12.28)岁；健康体检者20例，男13例，女7例，年龄28～56(41.65±9.90)岁。3组受试者一般资料比较，差异无统计学意义(

>0.05)，具有可比性。本研究获得杭州市西溪医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 纳入标准 PLC组纳入标准：①符合我国2019版PLC诊疗规范

临床诊断为PLC；②肝内占位病灶或肝外转移灶活检、外科手术切除组织标本，经病理组织学和(或)细胞学检查诊断为PLC；③未进行手术、射频消融、介入治疗(PEI、TACE等)、靶向治疗、放疗、化疗及免疫治疗等其他治疗的初诊患者。符合第①和(或)②条，并且同时符合第③条者。

肝硬化组纳入标准：①肝硬化诊断基于肝脏活检；②影像学显示肝脏回声粗糙呈结节状，肝体积缩小；③有门脉高压的征象，如脾大、腹水或静脉曲张。符合任意一条者。

观察组无效4例,有效19例,显效9例,,总有效率87.5%,对照组无效14例,有效17例,显效5例,总有效率56.25%,两组比较差异有统计学意义(X2=2.52,p<0.05)。

2.2 血清lncRNA HOTAIR表达水平与肝癌患者临床病理特征的关系 肝癌患者的TNM分期、Child-Pugh肝功能分级标准、肝外转移、血管侵犯、癌栓形成、肿瘤大小均与血清高lncRNA HOTAIR表达量相关(

<0.05)，而与患者年龄、性别、AFP、功能状态(PS)评分、伴有乙型肝炎、肿瘤数目方面则差异无统计学意义(

>0.05)，见表2。

1.3 研究方法

2.4 血清lncRNA HOTAIR对肝癌TNM分期预测 ROC分析结果表明血清lncRNA HOTAIR预测肝癌TNM分期的曲线下面积为0.708(95%

=0.573～0.844,

=0.006 8)，最大约登指数为0.388，最优截断值为0.000 151，其敏感性和特异性分别为78.3%、60.5%，见图2。

2.1 3组受试者血清lncRNA HOTAIR表达水平情况 见表1。

(3)0～10 cm土层，0.05～0.25 mm和<0.0 5 mm粒径微团聚体有机碳对总有机碳有显著作用；10～20 cm土层，在1～2 mm、0.05～0.25 mm粒径，团聚体有机碳对总有机碳有显著作用；20～40 cm和40～60 cm土层有机碳对团聚体有机碳影响不明显。这与植物根系分布深度及耕作施肥深度有关，同时也说明了红壤有机碳的增加通过形成或进入小团聚体而实现。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。对所有资料均进行正态性检验，计量资料组间比较采用

检验和单因素方差分析，计数资料组间比较采用 χ

检验。用受试者工作特征曲线(ROC)评价lncRNA HOTAIR的诊断效能，以

<0.05为差异有统计学意义。

由表4可知，本实验所选用的模型显著（P＜0.0001），失拟项P=0.505＞0.05，不显著；模型的校正系数RAdj2=0.9911，相关系数R2=0.9678，说明该模型拟合程度良好，试验误差小，可以用此来分析和预测壳聚糖-明胶复合澄清剂的澄清作用。由表4回归方程系数显著性检验可知，壳聚糖对20%vol红枣白兰地透过率的影响极显著（P＜0.01），明胶对20%vol红枣白兰地透过率的影响极显著（P＜0.01）；二次项AB、A2和B2也对透过率影响极显著（P＜0.01）。这表明各试验因素对透过率的影响呈二次关系，且因素之间存在交互作用。

2 结果

1.3.2 RNA提取及qRT-PCR检测lncRNA HOTAIR 本研究所有lncRNA检测均在杭州艾迪康医学检验中心实验室进行，检测方法采用qRT-PCR法检测。采用RNA分离试剂盒(DP503，天根生物科技有限公司)从血清样品中提取总RNA。对每个样本的每个基因进行 3次重复试验。以1 μg总 RNA 为模板，用逆转录试剂盒(FSQ-201，东洋纺生物科技有限公司)合成cDNA。以RNA 18S作为内源性参照，采用20 μl qRT-PCR反应体系(QPK-201，东洋纺生物科技有限公司)。取cDNA置于PCR扩增仪中扩增，反应条件如下：95℃ 1 min，95℃ 15 s, 60℃ 40 s，共40循环；采用2

法测定lncRNA HOTAIR的相对表达量。HOTAIR上游引物：5'-AAACAGAGTCCGTTCAGTGTCA-3'，下游引物：5'-TTCTTAAATTGGGCTGGGTC-3'；内参RNA 18S上游引物：5'-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3'，下游引物：5'-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3'。

正常对照组纳入标准：经实验室检验、超声、CT等辅助检查排除恶性肿瘤、慢性内科疾病、传染病等疾病史的健康者。

PLC是全球最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康

。肝癌的早期发现可使患者能够接受早期治疗，有效延长患者生存时间

。目前血清甲胎蛋白检测是PLC早期筛查最常用的检查方法，但此方法不易发现早期微小癌灶，灵敏度较差，易漏诊

。超声造影、增强CT、MRI对于微小癌灶的诊断具有一定优势，但也存在着创伤性大、费用高、患者依从性差等不足，故不适于人群早期大规模筛查

。因此，寻找能够在早期诊断PLC的灵敏度及特异性高、创伤小的肿瘤生物标志物十分重要，有利于提高PLC患者预后

。

数字货币是一种以电子形式存在的货币，不再像虚拟货币一样局限于网络游戏，而是能够像法币一样购买真实的物品。密码货币是数字货币的重要组成之一，利用严谨的密码学原理进行货币的产生、记账和交易。自从第一个密码货币即比特币诞生后，诸如以太坊、门罗币和零币等一系列密码货币相继面世，密码货币市场呈现井喷式发展；但是密码货币在具有价值的同时，也伴随着一定的风险。分析密码货币的生成和运行原理能够让人们对数字货币有更深的理解，从而做到理性投资。

1.3.1 血液样本采集 血清lncRNA检测需要收集所有纳入受试者废弃静脉血5 ml(肝癌患者选择术前3 d内废弃血清)，3 000 r/min高速离心10 min,吸取血清至1.5 ml 无酶离心管中，-80℃保存。血清AFP测定需抽取所有纳入组成员清晨空腹状态下静脉血3 ml, 3 000 r/min高速离心10 min,将血清分离，-80℃保存。

3 讨论

2.3 血清lncRNA HOTAIR对肝癌患者诊断价值 ROC分析结果显示血清lncRNA HOTAIR诊断肝癌的曲线下面积为0.991(95%

=0.975 8～1.000，

<0.001)，最大约登指数为0.907，最优截断值为0.00 004 911，其敏感性和特异性分别为95.7%、95.0%，见图1。

多项研究表明，在肿瘤发生、转移等多种细胞生物学进程中，lncRNAs都是重要的表观遗传学调控因子

。而血清lncRNAs能否应用于肝癌的早期诊断受到了研究者们的关注。Wang等

研究发现血清lncRNA-p21可作为肝炎感染、乙型肝炎肝硬化、酒精性肝病、HBV相关性肝癌患者肝细胞损伤的潜在生物标志物。Yu等

报道血清lncRNA PVT1和uc002mbe.2与HCC肿瘤大小、BCLC分期、血清胆红素相关。一项纳入820例 HCC患者和785例健康者的Meta分析结果表明，血清lncRNAs在肝癌诊断上具有较高的临床价值，可用于辅助肝癌诊断

。

HOTAIR是一种在多种肿瘤中起致癌作用的lncRNA

。研究表明，lncRNA HOTAIR与肝癌密切相关， Zhong等

研究发现HOTAIR在肝癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织，在体外实验中HOTAIR的沉默会促进肝癌细胞的凋亡，抑制细胞增殖。Gao等

实验发现HOTAIR对HCC的复发和转移的机制一部分是通过Wnt/β-catenin信号通路实现。Yasuyuki等

发现，肝恶性肿瘤的大小与HOTAIR高表达相关，高表达的HOTAIR是通过加强ATG7和ATG3表达使肝癌细胞的自噬能力增加，从而促进癌细胞增殖、扩散。

建议：不建议术前长时间的禁食禁饮。术前无胃肠动力障碍或肠梗阻的患者，麻醉前8 h禁食高脂高蛋白食物，麻醉前6 h禁食固体食物，麻醉前2 h可口服300 mL以内的清流质。

本研究发现血清lncRNA HOTAIR在PLC患者中的表达量明显高于肝硬化组、健康组。在临床病理因素方面，HOTAIR表达与肝癌患者的TNM分期、Child-Pugh肝功能分级标准、肝外转移、血管侵犯、癌栓形成、肿瘤大小显著相关。说明PLC恶性程度越高，lncRNA HOTAIR表达水平越高，提示lncRNA HOTAIR可能参与了PLC的恶性转化及增殖扩散过程。而肿瘤大小一定程度上反映了肿瘤负荷情况，当肿瘤体积较大时，其合成及释放的lncRNA HOTAIR会越多。此外，ROC分析结果显示血清HOTAIR对肝癌诊断的敏感性和特异性分别为95.7%、95.0%，提示了其对PLC诊断具有较高的潜在价值；而结合PLC患者血清lncRNA HOTAIR表达量明显高于慢性肝硬化患者的结果，提示其也可用于慢性肝硬化发展至肝癌的早期预防诊断。而血清lncRNA HOTAIR对肝癌TNM分期的ROC分析结果显示敏感性和特异性分别为78.3%、60.5%，当HOTAIR表达量>0.000 151时，预示肿瘤恶性程度可能更高。

综上所诉，本研究结果提示了血清lncRNA HOTAIR高表达对PLC的诊断及慢性肝硬化患者的预防肝癌监测具有较好的临床价值。因本次研究受试者随访数据不够充分，尚未对血清lncRNA HOTAIR对PLC患者预后意义作分析，后续随着样本量扩大、随访时间及数据更加完善，会进一步研究血清lncRNA HOTAIR能否成为PLC患者预后监测的有效指标。

[1] Yang JD, Hainaut P,Gores GJ，

. A global view of hepatocellular carcinoma: trends, risk, prevention and management[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2019, 16(10): 589-604.

[2] Anwanwan D, Singh SK, Singh S，

. Challenges in liver cancer and possible treatment approaches[J]. Biochim Biophys Acta Rev Cancer,2020,1873(1):188314-188325.

[3] Lao Y, Li Q,Li N,

. Long noncoding RNA ENST00000455974 plays an oncogenic role through up-regulating JAG2 in human DNA mismatch repair-proficient colon cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2019, 508(2):339-347.

[4] Yang Z, Zhou L, Wu LM,

. Overexpression of long non-coding RNA HOTAIR predicts tumor recurrence in hepatocellular carcinoma patients following liver transplantation[J]. Ann Surg Oncol,2011, 18(5):1243-1250.

[5] 中华人民共和国国家卫生健康委员会医政医管局.原发性肝癌诊疗规范(2019年版)[J].中华肝脏病杂志, 2020, (2): 112-128.

[6] Sia D, Villanueva A, Friedman SL,

. Liver Cancer Cell of Origin, Molecular Class, and Effects on Patient Prognosis[J]. Gastroenterology, 2017, 152(4): 745-761.

[7] Shiani A,Narayanan S,Pena L,

.The role diagnosis and treatment of underlying liver disease for the prognosis of primary liver cancer[J].Cancer Control,2017,24(3):27-41.

[8] Mehinovic L, Islamagic E, Husic SA,

. Evaluation of diagnostic efficiency of alpha-fetoprotein in patients with liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma: single-center experience[J]. Open Access Maced J Med Sci, 2018, 6(9): 1668-1673.

[9] Ayuso C, Rimola J, Vilana R,

. Diagnosis and staging of hepatocellular carcinoma (HCC): current guidelines[J]. Eur J Radiol, 2018, 101: 72-81.

[10] Gao YX, Yang TW, Yin JM,

. Progress and prospects of biomarkers in primary liver cancer (Review)[J]. Int J Oncol, 2020, 57(1): 54-66.

[11] Amaral PP, Leonardi T, Han N,

. Genomic positional conservation identifies topological anchor point RNAs linked to developmental loci[J]. Genome Biol, 2018, 19(1): 32-40.

[12] Wang S, Jiang J, Zhang C,

. Serum lincRNA-p21 expression in primary liver diseases and liver metastatic diseases[J]. Pathol Res Pract, 2019, 215(4): 779-783.

[13] Yu J, Han J, Zhang J,

. The long noncoding RNAs PVT1 and uc002mbe.2 in sera provide a new supplementary method for hepatocellular carcinoma diagnosis[J]. Medicine (Baltimore), 2016, 95(31):4436-4447.

[14] Zheng C, Hao H, Chen L,

. Long noncoding RNAs as novel serum biomarkers for the diagnosis of hepatocellular carcinoma: a systematic review and meta-analysis[J]. Clin Transl Oncol, 2017, 19(8):961-968.

[15] Rajagopal T, Talluri S, Akshaya RL,

. HOTAIR lncRNA: A novel oncogenic propellant in human cancer[J]. Clin Chim Acta, 2020, 503: 1-18.

[16] Zhong DN, Luo YH, Mo WJ,

. High expression of long noncoding HOTAIR correlated with hepatocarcinogenesis and metasta-sis[J].Mol Med Rep, 2018, 17(1): 1148-1156.

[17] Gao JZ, Li J, Du JL,

. Long non-coding RNA HOTAIR is a marker for hepatocellular carcinoma progression and tumor recurrence[J]. Oncol Lett, 2016, 11(3): 1791-1798.

[18] Fujisaka Y, Iwata T, Tamai K,

. Long non-coding RNA HOTAIR up-regulates chemokine (C-C motif) ligand 2 and promotes proliferation of macrophages and myeloid-derived suppressor cells in hepatocellular carcinoma cell lines[J]. Oncol Lett, 2018, 15(1): 509-514.