兜兰属植物花期调控研究进展

2022-04-27尹玉莹房林李琳陈砚符稳群吴坤林曾宋君

热带作物学报 2022年4期

尹玉莹　房林　李琳　陈砚　符稳群　吴坤林　曾宋君

摘要：兜蘭由于独特的花朵造型、绚丽的花朵色彩、持久的观赏花期而具有极高的观赏价值，是国际上的高档花卉。但由于生态环境的破坏以及人们对其过度采挖，兜兰现已成为世界上最濒危的植物物种之一，许多种类已濒临灭绝，所有兜兰野生种均被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）附录I而被禁止交易。目前，市场上流行的兜兰品种大多是由台湾等地利用无菌播种获得的杂交种或少量原生种，但由于兜兰属植物的生长习性复杂、生长周期长、花期种间差异大，至今尚无有效的花期调控技术。兜兰为典型的合轴生长方式，花芽产生于每年开花前后从基部分蘖出的新侧芽。兜兰属植物为总状花序，具多花原基，多花种类（或品种）的副花同时或先后发育;单花种类（或品种）是由于副花花芽分化后停止发育所引起的。开花时间与开花丰度是2个非常重要的园艺性状。光照、温度、植物生长调节剂和肥料是影响植物开花的主要因素。对于主要分布在热带地区的兜兰属植物而言，光周期对其花期的影响不显著;温度是促进春花型兜兰从营养生长进入生殖生长的关键因素;赤霉素（GA）和6-苄基嘌呤（6-BA）单独施用或结合施用均可以有效调控花期，一些单花种类利用植物生长调节剂可促进单花类的副花发育形成双花或多花;开花前定期喷施低浓度的含高磷高钾的水溶肥也可以有效提前花期。本文在对兜兰属植物生长习性、花芽分化方式和花期调控技术等相关研究进行综合分析的基础上，参考其他兰花花期调控的方法，提出了兜兰属植物花期调控技术及分子机制的主要研究方向，以期为兜兰属植物的花期调控及兜兰商品化生产提供参考。

关键词：兜兰;生长习性;花芽分化;花期调控中图分类号：S682.31 文献标识码：A

Advances in Flowering Regulation of

YIN YuyingFANG LinLI LinCHEN XianFU WenqunWU KunlinZENG Songjun

1. Key Laboratory of South China Agricultural Plant Molecular Analysis and Gene Improvement， South China Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Guangzhou 510650， China; 2. University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China; 3. Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Botany， South China Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Guangzhou 510650， China; 4. Yunfu Renshan Chengtou Agricultural Development Co.， Ltd.， Yunfu， Guangdong 527300， China; 5. Department of Biological Science & Technology， Minnan Normal University， Zhangzhou， Fujian 363000， China

species， popularly known as slipper orchids because of the resemblance of the pouch-shaped lip to a lady’s slipper， gorgeous flower color and long-lasting flowering， have captured the interest of many orchid growers and hobbyists and are one of the most popular and rare orchid genera being sold and exhibited today. Wild populations are under the threat of extinction as a result of over-collection， loss of suitable habitats， and all species are listed in the Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora （CITES） Appendix I and the trade is prohibited. At present， most of the popular species on the market are hybrids or a small number of native species obtained by asymbiotic seed germination in Taiwan and other places. Due to its long growth cycle， large differences among species and diverse flowering habits， it is difficult to achieve effective flowering regulation. has a sympodial habit of growth. After blooming， the plant will resume growth at the base of the previous shoot. The apical meristem of each new growing shoot continually differentiates its leaves until it initiates flower buds under proper environmental conditions. The is a raceme with polyfloral primordia. The dominant flower and lateral flower （s） of polyfloral species or varieties develope simultaneously or successively. However， the single flower species or varieties are caused by the cessation of development of lateral flower buds after differentiation. Flowering time and flowering abundance are two very important horticultural traits. Light， temperature， plant growth regulators and fertilizers are the main factors affecting plant flowering. For the species mainly distributed in tropical regions， the photoperiod has no significant effect on the flowering period. Temperature is a key factor to promote the growth of spring-flowered from vegetative growth to reproductive growth. Gibberellin （GA） and 6-benzylpurine （6-BA） alone or in combination can effectively control the flowering period. The use of plant growth regulators in some monofloral species could promote the development of lateral flowers to form double or multiple flowers. Regular spraying of low-concentration water-soluble fertilizers containing high phosphorus and high potassium before flowering can also effectively advance the flowering period. This article reviews the related researches on the growth habit， flower bud differentiation and flowering regulation technology of . With reference to other methods of orchid flowering period regulation， suggestions for flowering regulation are put forward in order to provide reference for the research on the flowering regulation technology and the commercial production of .

; growth habit; flower bud differentiation; flowering regulation

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.04.013

兜兰是兰科（Orchidaceae）兜蘭属（ Pfitzer）植物的统称，其显著特征为唇瓣特化成兜状或拖鞋状，颇似女性的拖鞋，故又称为“拖鞋兰”或者“仙履兰”等。兜兰属植物花型奇特、花色艳丽、花期长，具有极高的观赏价值。目前兜兰生产已由趣味栽培转为商业栽培，除了作为高档盆花广受人们喜爱以外，也逐渐进入切花市场，兜兰也将成为继蝴蝶兰之后又一需要高技术、具有高经济价值的花卉代表。由于过度采集和栖息地的破坏，大部分野生兜兰处于濒临灭绝的困境，所有野生种类均被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）的附录I中并禁止交易。因此市场上流行的兜兰大多为人工栽培的杂交种，以斑叶单花魔帝型（Maudiae type）及绿叶单花的复合杂交品系标准型（Complex type）为主流，多花型兜兰的数量较少。但由于杂交种无菌播种后其后代性状会发生分离，品质不稳定，花期不一致，难以按计划进行规模化生产，特别是兜兰的无性克隆技术还不成熟，难以获得遗传背景一致的商品杂交种用于花期研究，严重阻碍了兜兰产业的发展。目前，兜兰规模化栽培程度较低，不同种类或品种由于遗传背景的差异对环境条件的要求不同，难以实行统一的栽培管理方法，尽管已有一些兜兰栽培和花期调控研究的报道，但由于采用传统兰花的水肥栽培和自然开花的生产模式，尚无有效且精准的花期调节技术使其应节开花。本文对兜兰属植物生长习性、花芽分化和花期调控技术的研究进展进行综述，参考其他兰花花期调控的方法，提出兜兰属植物花期调控的研究方向及建议。

兜兰的生长习性

兜兰为多年生草本植物，叶近基生，呈2列排列于短缩的茎上，茎下端与短缩的根状茎相连接。全属约有109种，主要分布于热带亚洲，从印度向东跨越中国南部到菲律宾和整个东南亚和马来群岛新几内亚和所罗门群岛。我国兜兰属植物种质资源丰富，主要分布于西南和华南地区，约有27个种。大多数兜兰属植物生于地面或积土的岩石表面或岩缝中，较少数着生于树上。兜兰为典型的合轴（sympodial）生长方式，每年开花前后会从基部分蘖出新的分蘖芽，分蘖芽进一步生长发育并开花。其开花习性多样，在自然光照和温度的温室栽培条件下，同色兜兰（）一年四季都能开花，而胼胝兜兰（）只能在4—5月开花，长瓣兜兰（）则主要在7—9月开花，波瓣兜兰（）的花期集中于10—12月。

兜兰的花芽分化

兜兰属植物的花序轴一般可着生1～15朵花。多花短瓣组（Sections ）、多花长瓣组（Sect. ）和多花无耳组（Sect. ）为多花的总状花序，通常具3朵或3朵以上花，同时开放或相继开放;其余种常为单花，但所有单花种都孕育有1个以上败育花芽在其顶端苞片处，在适宜的条件下，这些花芽也能开放形成双花或多花现象。如白旗兜兰（）在正常栽培条件下多为单花，偶尔会出现双花。

皮秋霞等通过形态解剖研究了杏黄兜兰（）成花的过程，发现杏黄兜兰通常可以分化出2～3朵小花，但往往只有1朵花发育最早，最终开放，其他小花在发育过程中停止发育。通常情况下，杏黄兜兰产生复杂花器官所用的时间仅为半个月或更短，而从花器官形成至花开放，则一般需要6～8个月左右的时间，即当年9月形成完整花芽，直到次年2—4月花开。此外研究发现杏黄兜兰的分蘖芽集中于母株开花前后出现，母株一般产生1～2个分蘖芽。从营养物质分配的角度来分析，在转入生殖生长之前，杏黄兜兰的营养物质优先分配给母株的营养器官（叶片），供其生长，以同化、积累更多营养，至转入生殖生长后，营养物质主要分配给生殖器官，供其进行形态建成。只有在花已完成生长或开放后，分蘖芽才成为主要的营养分配库，开始迅速生长分化，长出母体。CribB认为多花花序是杓兰亚科中较为原始的特征，推测兜兰属植物可能在其进化过程中，不再需要通过多花表型来达到其繁殖的目的，因此其多花总状花序不断减退，养分集中于供应单朵花的发育并产生新的分蘖芽，使有性繁殖与无性繁殖达到最优分配。然而在实际生产中，往往丰花表型具有更高的商品价值。陈影通过对魔帝兜兰（Maudiae）实生苗进行赤霉素处理，发现喷施赤霉素会出现一梗双花现象，不同浓度（1、10、50、100 mg/L）处理的魔帝兜兰，其总双花率平均达10%，对照组无双花。另外，在研究中也发现，大部分兜兰种类开花后一般每年只能长出1个侧芽用于第2年开放，但我们审定的园春兜兰（× ）、迎春兜兰（× ）等具有较强的分蘖能力，1个芽开放后能形成2～3个侧芽，每个侧芽第2年能开花，开花数多。因此，在研究过程中，一方面可以通过刺激未完全发育的小花继续发育出来，形成一梗双花或多花实现丰花表型;另一方面可以通过杂交育种的手段培育出分蘖能力强的杂交种实现丰花。

花期调控技术

光照调控

光在植物的生长发育过程中极其重要。光质、光强与光周期均能影响植物的光合作用进而影响植物的正常生长。在一些兰科植物中已经证明，成花诱导受光周期调控。Wang等研究认为，蝴蝶兰（）在30℃/20℃（昼/夜）条件下，9 h光照比16 h光照更能有效地促進花芽萌发。Lopez等认为在低温处理之前对盆栽堇花兰（）进行4周或8周的短日照处理（光照时间9 h/d），可以极大地促进开花，开花量达到90%以上，而且出花整齐。然而对于主要分布在热带地区的兜兰属植物而言，光周期对其花期的影响不显著。

温度调控

对于多年生热带低地兰科植物而言，光周期对其开花的影响有限，环境温度的变化可能在调控其花期的过程中起着更重要的作用。其中兰科蝴蝶兰属（）植物为典型代表，生产上通过控制温度调控花期，实现规模化种植，达到终年生产的目的。研究表明当日温高于28℃时，花芽的萌动被抑制，使植株保持营养生长，当温度低于26℃时，蝴蝶兰可以完成成花诱导。除蝴蝶兰外，低温对石斛属（）、美堇兰属（）、轭瓣兰属（）植物开花均有促进作用。张嘉满等对兜兰3个亚属的8种材料进行较为系统的花期调控研究，分析了日照长度、日夜温度和植物生长调节剂等因素对兜兰开花的影响，结果表明，促进兜兰属植物开花的可能因子，除单花品系之杂交种魔帝型（ Maudiae type）外，主要受温度的调控。杂交种 Greyi和Magic Lantern于高温环境30℃/25℃下开花率为0%，20℃/15℃环境下均有88%的开花率。另外昼/夜温度25℃/15℃对原生种李氏兜兰（）白旗兜兰红旗兜兰（）和秀丽兜兰（）均有良好的催花效果。对于兜兰属的模式种波瓣兜兰而言，温度诱导（thermo-induction）可以有效促进其开花，即当植株持续暴露在18℃左右的温度下时，植株会无限期地保持在营养阶段。然而，如果植物在接近12℃的温度下有2～3周的温度诱导期，然后再回到较高的温度下，在很短的时间内就会开花。另外，Cribb也提出夜温的显著降低能促进多花的罗氏兜兰（）提前开花。

综上，结合兜兰的原产地来看，兜兰属植物主要分布在热带亚洲。其中在马来西亚、新加坡和印度尼西亚等地，季节性的暴风雨引起的温度下降可能是影响兜兰开花的主要因素。因此，可以通过空调温室调控昼夜温度或高山催花的方式探索影响兜兰开花的温度条件。

植物生长调节剂调控

在实际生产过程中，温度与光照控制具有高消耗、高成本、难度大的特点。而植物激素作为影响植物开花的重要因素，外施植物生长调节剂可部分取代光周期与温度等环境因子的催花效果，且成本低，易操作，因此应用广泛。通常情况下，对于蝴蝶兰属和石斛属植物而言，细胞分裂素刺激开花，而生长素会抑制细胞分裂素的作用，赤霉素单独应用时效果不明显，但与细胞分裂素联合使用时效果略有提高。虽然赤霉素无法诱导开花，但外施赤霉素可以逆转蝴蝶兰高温下无法开花的表型，但会造成花朵畸形。细胞分裂素与赤霉素联合使用，可改善畸形的发生。李秀玲等以带叶兜兰（P. hirsutissimum）和同色兜兰为试验材料，研究了2种兜兰在不同发育时期叶片中内源激素变化与开花的关系，结果表明，从大苗期到现葶期，带叶兜兰叶片中玉米素（ZT）含量显著降低，GA和生长素（IAA）含量显著升高。而同色兜兰叶片中GA、脱落酸（ABA）和IAA的含量均下降，玉米素核苷（ZR）含量无明显变化;从现葶期到初花期，带叶兜兰叶片中ZT的含量直线上升，GA的含量先降低后上升，IAA的含量急剧上升，GA/IAA的比值持续下降。同色兜兰叶片中ZR含量呈先上升后下降再上升的趋势，GA的含量变化不大，IAA和ABA含量先下降后上升，GA/IAA的比值持续上升。兜兰从大苗期到现葶期，完成了从营养生长到生殖生长的转变。从现葶期到初花期，涉及了花序和花器官的进一步发育。不同种兜兰其内源激素水平与其花芽分化的关系不尽相同。同色兜兰是兜兰属中较易种植、较易开花的种，一年四季都能开花，通常具1～2朵花，少数具3朵花。带叶兜兰为兜兰属中典型的春花型兜兰，于每年春季4—5月开花，通常单花。对于春花型带叶兜兰而言，现葶期叶片中GA含量（36.95 μg/g）显著高于大苗期GA含量（6.19 μg/g），说明带叶兜兰花朵形态建成需要更高水平的GA含量。对比双花同色兜兰和单花带叶兜兰从现葶期到初花期叶片中激素含量的变化趋势发现，兜兰叶片中GA和IAA的含量可能影响了花序的进一步发育，进而决定了开花数量和花朵品质。赤霉素对于兜兰属植物抽梗开花有促进作用，但不同种对赤霉素的浓度要求不同。陈俊成使用赤霉素GA与GA，可诱导Maudiae type开花，浓度以100 mmol/L的效果最好，但使用赤霉素会造成花梗不正常弯曲，整体花型不对称，上萼片内卷，形状变狭长，花瓣卷曲，子房变长等畸形花问题。Miguel等对4年生未开花的杂交种实生苗（Macabre × ）进行喷施GA实验发现，866 mmol/L GA使开花率达到100%，并导致花序伸长。萧元川研究了GA与BA对多花与单花组合形成的杂交品种（ ×Somers Isles）的影响，发现125 mmol/L GA可明显促进开花，BA在开花起始阶段与GA产生拮抗作用，但对花序发育则具有协同作用，并提出GA可能通过改变植物碳水化合物的代谢与分配从而促进开花的启动。

综上所述，由于兜兰花发育进程时间长，难以明确其关键发育时间节点，需进一步明确兜兰花芽分化的解剖显微过程，探索影响兜兰花芽分化的关键激素。目前可以确定赤霉素可以促进兜兰提前开花，但其作用机制有待进一步探讨。

营养调控

陈影研究了不同比例氮、磷、钾含量的花肥和植物生长调节剂处理对魔帝兜兰（Maudiae）花期的影响，结果表明喷施花多多2号高磷肥和花多多11号高钾肥能促进开花，施肥处理对魔帝兜兰花朵形态无显著影响。Wathanasakun- ek研究了不同的栽培基质与钙肥对兜兰开花的影响，结果表明树皮混合水苔以及颗粒海绵（granulate sponge）的组合栽培基质在促进花朵数量方面明显优于单一的树皮栽培基质，另外300 mmol/L钙肥处理后产生较多花朵。

分子生物学研究进展

近年来，组学技术的迅速发展大大推动了兰科植物开花相关分子机制的研究。目前已有7个兰科植物种类完成了全基因组测序，分别是深圳拟兰（）铁皮石斛（，）鼓槌石斛（）、小兰屿蝴蝶兰（）、香子兰（）和墨兰（Cymbidium sinense）。另外，转录组测序技术可以全面快速地获取特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息。目前，借助二代测序技术，对兰科植物开展了大量的转录组学研究。通过比较转录组分析，筛选差异表达基因，有助于更好地了解复杂开花调控网络间的关系，发现新的开花调控网络，为进一步深入挖掘兰科植物开花相关特异性关键基因提供重要参考。通常情况下，对于石斛属植物，低温与细胞分裂素均能诱导其开花。为探究春化和细胞分裂素信号通路在开花调控网络中的关系，Wen等通过比较转录组研究了对照组、冷处理组和细胞分裂素处理组间的差异表达基因，发现低温促进细胞分裂素信号通路上关键基因的表达，且低温与细胞分裂素处理均能触发（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1）（LEAFY）（APETALA1）和赤霉素信号通路关键基因显著上调，说明低温、细胞分裂素和赤霉素信号通路相互作用共同调控石斛属植物开花。低温同样能促进蝴蝶兰属植物开花，Huang等对低温和高温处理的蝴蝶兰植物腋芽的转录组进行了分析和比较，发现低温诱导赤霉素合成基因的表达，说明在低温条件下，赤霉素通路可能也在蝴蝶兰花期调控中发挥重要作用。与石斛和蝴蝶兰相反，文心兰属（）植物通常在高温（30℃）条件下完成成花转变。通过比较转录组研究发现，高温胁迫环境下，氧化还原内稳态平衡可能是诱导文心兰在高温环境下开花的内源性信号之一。因此，不同的兰科植物进化出与其生长环境相关的特异性花期调控机制，多种花期调控信号通路相互作用共同调控植物完成成花转变。同时，越来越多与兰科植物开花相关的关键开花基因被挖掘，Wang等综述了近年来国内外对兰花开花基因的研究进展。

兜兰属植物由于其材料自身的局限性，其开花相关分子机制研究进展较慢。王燕君等利用SMART策略构建了硬叶兜兰花芽的抑制性消减杂交（SSH）文库，得到了18条差异表达片段，通过序列比对，发现这些差异表达基因含有多个转座子和反转录转座子的同源基因，可能参与硬叶兜兰的花发育调控過程。李冬梅等从同色兜兰中分离了花器官发育相关的2个MADS-box基因和。通过氨基酸序列比对、蛋白结构域和系统进化树分析表明，和分别属于B类MADS-box蛋白家族的AP3和PⅠ亚家族。表达分析显示，和在花芽发育中均有表达，在成熟花、唇瓣和花瓣中的表达量高，在蕊柱、萼片、苞叶和根中次之，在花茎和叶中较低，在子房中几乎不表达;在各组织中均有不同丰度的表达。通过二代测序技术，已对杏黄兜兰的成熟花芽进行测序，能为兜兰的分子生物学提供信息。然而，仅从一个物种和一个发育阶段获得花芽的转录组数据是远远不够的。因此，来自不同种类和发育阶段的花芽转录组数据将有助于获得更全面的数据资源和深入了解兜兰的开花机制。LI等利用高通量测序技术对同色兜兰、硬叶兜兰和2个常见的栽培品种‘红魔帝’（ Red Maudiae）和‘绿魔帝’（Green Maudiae）的混合花芽分别进行转录组测序，在对高温途径相关基因进行同源序列分析时发现基因只存于高温下开花的兜兰中，推测在部分兜兰中基因对夏/秋开花型兜兰有正向调节作用。另外和可能是调节兜兰成花（大小和结构）和开花时间的关键基因。

锁定关键开花基因后，需要对其进行功能验证。与模式植物拟南芥不同，兰科植物为单子叶植物，具有基因组大、转化效率低、再生周期长、生长缓慢的特点。因此，常通过在拟南芥、水稻或烟草中异源表达相关基因的方式间接验证基因的功能。另外，病毒诱导的基因沉默及转基因技术是通过反向遗传学的方式研究兰花基因功能的有效途径。目前在重要商品兰花，如蝴蝶兰与石斛中形成了较为成熟的功能基因验证方法。Hsieh等报道了一种利用大花蕙兰花叶病毒（CymMV）作为沉默载体，通过农杆菌侵染花序或叶片，诱导蝴蝶兰基因沉默的优化方法，并成功沉默和等基因，诱导显著的表型，其沉默效率高达95.8%。随后，Jang等运用该方法成功验证了敲除蝴蝶兰植株的表型。组织培养技术的发展，将有助于兰花基因的功能研究和具有商业价值性状的兰花基因工程。由于蝴蝶兰与石斛均具备了成熟的组培再生体系，借助组织培养技术，Hsing等以蝴蝶兰原球茎为受体材料，优化了一种高效可遗传的农杆菌介导的遗传转化体系，获得了大约1.2%～5.2%的转化率。CHAI等以石斛愈伤组织为受体材料，利用L-methionine sulfoximine（MSO）作为选择剂，优化了一种高效的基因枪介导的遗传转化体系。该体系已成功应用于过表达转基因石斛兰品系的建立。

然而，相较于蝴蝶兰与石斛属植物，兜兰属植物开花相关基因的研究起步较晚，遗传转化体系尚不成熟。近年来，兜兰属植物非共生萌发离体快繁技术体系不断取得新的突破，为建立兜兰属植物遗传转化奠定了一定基础。一些兜兰种子在经非共生萌发产生原球茎后，通过培养基和培养条件的调控可以通过原球茎诱导出愈伤组织或类原球茎完成再生过程，通过成熟的愈伤组织或类原球茎再生体系进行遗传转化。张莉以魔帝兜兰的原球茎为受体材料，利用农杆菌子房注射法、农杆菌介导法和基因枪法对魔帝兜兰遗传转化进行了初步探究。研究发现利用农杆菌子房注射法转化魔帝兜兰的最佳注射时间为授粉后48～53 d，证实最佳注射时间为魔帝兜兰的受精时间。在农杆菌介导法中，对原球茎进行针刺处理可以最大限度地获得抗性受体材料，抗性受体材料的获得率高达4.17%;用农杆菌侵染液侵染受体材料20 min时获得率最高，为5.00%;侵染后受体材料最合适的共培养时间为3 d，其获得率为4.17%;在共培养基内添加200 μmol/L AS的转化效率为5.83%，均高于其他浓度的转化率。另外在基因枪介导法中发现，在基因枪轰击前对受体材料进行甘露醇高渗处理，含0.3 mmol/L甘露醇的高渗培养基的获得率高达6.67%;利用直径为0.6 μm的金粉在9 cm的轰击距离下进行轰击的获得率最佳;轰击后的受体材料在恢复培养基下培养20 d后再进行筛选培养的获得率最高。LUO等通过激光共聚焦显微镜对魔帝兜兰的胚胎发育过程进行了显微观察，发现其在受粉后40～45 d是受精期，在此期间进行子房注射能获得较高的转化率，最高可达2.54%。为了更好地了解兜兰属植物基因的功能，加速兜兰分子育种研究，需要继续探索适合兜兰属植物更可靠、更稳定、更高效的遗传转化体系。

近年来，新的分子工具不断涌现，为植物定向分子育种提供了强有力的技术保障。通常，兜兰属等多年生植物通过传统杂交育种的方式获得多个优良性状集于一体的杂交组合的效率较低。基因编辑技术如CRISPR-Cas9为获得非模式生物的无效突变体（null mutation）和多点突变体（multiple mutant）提供了一个便捷的工具。这一技术的出现不仅有助于兰花分子遗传学研究，而且有助于通过靶向基因编辑产生具有各种优良性状的新型兰花品种。目前，在小兰屿蝴蝶兰中，已成功利用CRISPR/Cas9获得了MADS基因（、和）的多点突变体，三重突变率高达97.9%。同时还获得了单突变体和双突变体以了解不同基因突变对花发育的影响。今后，借助新型分子技术的发展，兜兰属植物的基因编辑技术也将日渐成熟，花期调控研究也将更加深入和全面。另外，近些年表观遗传（DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA、染色质重塑）与开花途径间的机理研究越来越深入，尤其是表观调控在春化途径（vernalization pathway）和年龄途径（age pathway）中发挥着重要作用。是春化途径调控拟南芥开花的关键调控因子，春化对表达抑制的维持主要是通过与位点结合的非编码RNA（和）的表达和基因上组蛋白修饰来实现的，其中植物多梳蛋白抑制复合体（polycomb repressive complex2， PRC2）以及PRC1-like复合物起着重要作用。年龄途径中短链（20～24个核苷酸）非编码RNA（micRNA）miR156、miR172及其靶基因SPLs组成年龄途径的关键调控因子，确保植物在非诱导条件下开花。兜蘭属植物为无限的总状花序，外界环境因素极大地影响其开花数量与花朵品质。如单花的麻栗坡兜兰（）和杏黄兜兰（）在适宜的环境条件下甚至能开出3～4朵花。表观遗传调控极有可能参与其成花诱导，影响其开花。目前尚未发现通过表观遗传修饰调控兜兰花期的研究。在其他观赏植物如菊花、杜鹃花和矮牵牛中均发现，使用DNA甲基化抑制剂处理植株后，花期提前。说明去甲基化能调控开花基因的表达，促进提前开花。因此，在兜兰属植物中可以尝试进一步探究表观遗传修饰模式如DNA甲基化水平、组蛋白修饰的类型和非编码RNA的种类的改变对其开花的影响。

问题与展望

综上所述，兜兰属植物花期调控研究进展较为缓慢主要原因有以下几点：（1）材料自身的局限性。由于兜兰在自然界繁殖难度大，难以获得足够数量的原生种用于研究，特别是兜兰属所有野生种类均被列入CITES的附录I后更不可能获得;其次，利用无菌播种生产出的原生种实生苗从出瓶到开花，一般需要2～6 a时间，生长周期长，同时，由于其抗性较差，较少应用于商品化规模生产。（2）种间差异大，开花习性多样。例如，在自然光照和温度下进行温室栽培，同色兜兰一年四季都能开花，而带叶兜兰只能在4—5月开花。我国华南地区栽培的两大流行品种‘红魔帝’和‘绿魔帝’一年四季开花，但其遗传背景不一致，不是理想的花期调控研究材料。（3）缺乏参考基因组序列信息。借助转录组研究，虽然能加快探究兜兰开花分子机制的步伐，但由于缺乏参考基因组，采用从头组装的方式进行组装的序列信息，注释较差，大部分序列不具有全长cDNA特征，因此后期进行基因功能研究难度较大。（4）尚未建立成熟的组织培养体系和遗传转化体系。由于兜兰杂交种具有丰富的花型、花色和较好抗性等杂种优势，目前市场上销售的兜兰多为杂交种，但采用杂交种为亲本的同一杂交组合的实生苗，个体生长习性具有巨大的差异，花期也不一致，如魔帝类兜兰的杂交后代，不但花色变化极大，花期也极不一致，大部分组合的杂交后代一年四季均可开花，因此在开展花期试验时难以获得足够数量遗传背景一致的材料用于花期调控研究。

针对上述问题，利用组织培养建立兜兰快繁体系获得足够数量且品质均一的组培苗是花期调控研究的关键，华南植物园在兜兰属植物组织培养方面取得了较好的进展，已成功建立了魔帝类兜兰组织培养技术体系并生产出大量的试管苗，可用于花期调控研究。另外，近年来随着第3代测序技术的成熟和成本的大幅降低，借助太平洋生物科学公司（Pacific Biosciences， Pac Bio）的单分子实时（single-molecule real-time， SMRT）测序技术或牛津纳米孔技术公司（Oxford Nanopore Technologies， ONT）的单分子纳米孔测序技术，采用三代联合二代的测序策略，可以获得具有更高可信度的差异表达分析和数据发掘结果，有效弥补了二代测序技术出现的大部分序列不具有全长cDNA特征的缺点，有助于功能基因的克隆和功能验证，也能更有效地开展兜兰花期调控等相关分子机制研究。

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