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一种新的水稻香味基因功能标记的开发与应用

2022-04-27刘文静胡文彬周政刘烨赵正洪徐庆国

热带作物学报 2022年4期
关键词：条带香型引物

刘文静　胡文彬　周政　刘烨　赵正洪　徐庆国

摘  要：香味是影響稻米品质的一个重要性状，Badh2基因突变是水稻产生香味的主要原因，水稻香味产生主要有Badh2基因第2、4、5、7、8外显子突变类型，其中研究最多的是第7外显子突变类型。为了提高水稻香味性状检测的准确性、安全性和效率，本研究根据水稻Badh2基因突变（第7外显子8 bp缺失、3 bp突变）的序列设计开发了3条分子标记引物，分别命名为Fgr-FF、Fgr-NF和Fgr-R，利用该三引物分子标记法可准确扩增出Badh2第7外显子突变基因，并鉴定其纯杂合情况。本标记利用PCR扩增中引物5?端保守性差的特点，将31 bp外源DNA序列添加至Fgr-NF引物的5?端，将Badh2基因第7外显子突变类型的非香型和香型特征条带差异由8 bp扩大至41 bp，通过琼脂糖凝胶就能准确、清晰、快速地检测出水稻植株中香味基因的纯合、杂合和无3种基因型。利用该三引物分子标记的PCR扩增结果表明：该标记在香型水稻中扩增出一条115 bp的特征条带，在非香型水稻中扩增出一条156 bp的特征条带，而在杂合型水稻中能同时扩增出115 bp和156 bp两条特征条带。本研究利用该三引物功能标记对30个水稻品种香味基因型进行检测，结果检测出香味纯合植株9株，非香纯合植株20株，该检测结果与2种表型鉴定结果相符;杂合植株1株，这是由于水稻香味基因是隐性基因，杂合型水稻叶片表现为非香，部分籽粒表现为香;使用传统的香味鉴定方法容易对香味杂合型水稻产生误判，而通过基因检测结果和表型验证表明新开发香味三引物功能标记准确可靠;利用三引物功能标记对94个F2代单株的香味基因进行检测，结果检测出香味纯合植株23株，非香纯合植株44株，杂合植株27株，符合1∶2∶1孟德尔遗传的分离比例。该研究既避免了水稻香味鉴定与检测中KOH法和咀嚼法的主观误差，也解决了聚丙烯酰胺凝胶电泳的毒性强、耗时长等问题，大幅度地提高了香型水稻品种的选择效率。

关键词：水稻;香味基因;分子标记中图分类号：S511.2      文献标识码：A

Development and Application of a New Functional Marker of Fragrant Gene in Rice （Oryza sativaL.）

LIU Wenjing HU Wenbin ZHOU Zheng LIU Ye ZHAO Zhenghong XU Qingguo

1. Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128， China; 2. Hunan Rice Research Institute， Changsha， Hunan 410125， China; 3. State Key Laboratory of Hybrid Rice， Changsha， Hunan 410125， China

Abstract： Fragrance is an important trait which affects the quality of rice. The mutation ofBadh2 is the main contribution of fragrance in rice， and there are mainly several types of exon mutation， such as the second exon， the fourth exon， the fifth exon， the seventh exon and the eighth exon ofBadh2， and the mutation of the seventh exon is the most studied one. In order to improve the accuracy， safety and efficiency of rice fragrant detection， the molecular marker with three primers （3-primer marker）was designed based on the mutation of the seventh exon ofBadh2 （eight bp deletion and three bp mutation）， and three primers were named Fgr-FF， Fgr-NF and Fgr-R respectively. The mutation of the seventh exon ofBadh2could be detected accurately by the three3-primers molecular marker， and the homozygous and heterozygous of fragrant rice were identified. This marker took advantage of the poor conservation of the 5'end of primers in polymerase chain reaction （PCR）， added the 31 bp exogenous deoxyribonucleic acid （DNA） to the 5'end of the primer Fgr-NF. This marker enlarged the differences of length between the non-fragrant and fragrant bands of PCR from 8 bp to 41 bp， and the homozygous， heterozygous and non-fragrant genotypes of rice could be accurately， clearly and quickly detected by agarose gel electrophoresis. The results of PCR amplification with the three-primer marker indicated that： 115 bp DNA fragment in the fragrant rice， 156 bp DNA fragment in the non-fragrant rice， both 115 bp and 156 bp DNA fragments in the heterozygous rice. The 30 rice varieties were detected by the 3-primer marker. And the results showed that： there were nine fragrant homozygous genotype varieties and twenty non-fragrant homozygous genotype varieties， which were consistent with the two phenotypic identification methods， KOH method and chewing method. There was one heterozygous genotype variety， and its genotype identification results was inconsistent with the phenotypic identification results， because the fragrant gene of rice was recessive gene， the leaves of heterozygous rice were non-fragrant， while some grains were fragrant. The traditional fragrant identification methods were easy to misjudge the fragrance of heterozygous rice. However， These results of gene detection and phenotypic verification showed that the 3-primer marker designed by this study was accurate and reliable. The 94 individual plants from F2generation were detected by the 3-primer marker， and the results also showed that there were 23 fragrant homozygous plants， 44 non-fragrant homozygous plants and 27 heterozygous plants， which accorded with the 1∶2∶1 ratio of Mendelian genetic law. This study not only excluded the subjective error of KOH method and chewing method， but also avoided the toxicity and time consuming of polyacrylamide gel electrophoresis， and greatly improved the breeding efficiency of fragrant rice varieties.

Keywords： rice; fragrant gene; molecular marker

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.04.003

香味是水稻品质的一个重要性状[1]，具有香味的稻米深受消费者喜爱[2-3]，价格也比普通大米高[4-5]。香稻不仅品种多，而且类型复杂。为了进一步了解香稻香味的形成原因，早在20世纪80年代，研究人员就对水稻香味的成分、形成机理和遗传特点开展研究，结果发现香稻含有200多种香味物质，但与水稻香味直接相关的是2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrrolin， 2-AP）[6-8]，而2-AP的含量与水稻香味基因Badh2有关[9]。BARDBURY等[9]通过分析水稻DNA序列发现，Badh2基因在香型水稻和非香型水稻间有很明显的差异，并认为Badh2基因突变是水稻香味形成的主要基因。SHI等[10]通过对24份香稻材料测序发现，与非香型水稻相比，香型水稻Badh2基因的第2外显子存在7个碱基缺失。CHEN等[11]分析了香味形成的3个候选基因，发现只有Badh2基因与水稻香味有关。已有大量研究表明，位于水稻第8号染色体上的Badh2基因编码甜菜碱醛脱氢酶（betaine aldehyde dehydrogenase homologue 2， BADH2），Badh2基因的突变或者缺失，可引起甜菜碱醛脱氢酶减少甚至消失，造成作用底物2-AP代谢途径中断，以致2-AP前体物增加，进而2-AP在水稻中不断累积，产生香味[12-17]。

在香稻新品种育种中，研究人員常采用热水法[5， 18]、KOH法[19]、咀嚼法[20]和仪器测定法[21-22]等进行香味鉴定，这些方法主观影响大、准确性低、重复性差、效率不高。如何高效、安全、准确地鉴定水稻香味成为育种工作者急需解决的问题。随着香味基因的发现，分子标记逐渐成为香味检测的重要手段。本研究通过分析水稻中Badh2基因第7外显子突变基因序列，同时利用PCR引物5?端保守性差的特点，引入外源DNA序列，扩大片段大小差异，从而设计出通过普通PCR和琼脂糖凝胶就能分辨出香味基因的纯合、杂合和无3种状态的分子标记，为今后水稻香味基因分子标记辅助选择提供支持。

1  材料与方法

1.1  材料

本研究选用了124个水稻材料品种或种质材料，其中常规水稻品种27个，杂交水稻品种3个，‘湘晚籼13号ב谷梅4号的F2代单株材料94个。所有供试材料均于2019年6—11月种植在湖南省长沙市高桥基地，采用起垄湿润育秧，人工移栽，移栽规格20 cm×20 cm，1粒谷/蔸，常规水肥管理和病虫防治。所用试剂均购自于北京聚合美生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1  水稻香味鉴定  分蘖盛期，采用KOH浸泡法鉴定叶片的香味情况，具体操作：分别取约2 g的新鲜叶片，剪碎放入20 mL离心管中，然后加入1.7% KOH溶液10 mL并立即盖上盖子，室温下放置10 min，打开瓶盖由3人轮流闻香味的有无[19， 23-24];每个材料重复5次。成熟后，采用咀嚼法鉴定种子的香味情况，具体操作：随机取晒干种子15粒，人工一粒一粒放入嘴里慢慢嚼碎，然后吸一口气，让气流通过鼻子呼出，判断米粒香味情况;咀嚼每一粒之后用纯净水漱口。若米粒全无香味，则判定该材料为非香型;若米粒全有香味，则判定该材料为香型;若同时存在香型和非香型2种情况，则判定该材料属于杂合型[20， 23-24]。

1.2.2  分子标记  通过NCBI（https：//www.ncbi. nlm.nih.gov/gene/4345606）获得Badh2基因的全序列;根据该基因第7外显子的突变序列特征，同时结合PrimerPremier 5.0软件：在突变位点处设计1条香型正向引物和1条非香型正向引物，在突变位点下游设计1条共用反向引物;3条引物扩增的DNA片段均控制在200 bp以内;在非香型正向引物中加入31 bp T-DNA序列，扩大香型和非香型扩增产物差异。

1.2.3  DNA提取、PCR扩增及电泳检测  采用CTAB法（十六烷基三甲基溴化铵法）提取水稻叶片DNA[25]。PCR反应体系：总体积为20 μL，其中10×PCR Buffer 2.0 μL，10 mmol/L dNTPs 2.0 μL，10 μmol/L引物Fgr-FF和Fgr-R各0.4 μL，10 μmol/L引物Fgr-NF 1 μL，5 U/μLTaq DNA聚合酶0.2 μL，ddH2O 13 μL， DNA模板1 μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5 min;95℃变性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，共34个循环;72℃延伸5 min，?20℃保存。

电泳检测：配制质量分数（W/V）为2.5%～3.0%琼脂糖凝胶，按体积比1∶10000（Gelred：琼脂糖凝胶）加入无毒染料Gelred，7 V/cm电泳30 min;电泳完成后，拍照保存。

2  结果与分析

2.1 水稻香味基因三引物功能标记的开发

根据水稻Badh2基因第7外显子突变位点设计了非香型正向引物CTGGTAAAAAGATTATG GCTTCAG、香型正向引物CTGGTATATATTTC AGCTG（Fgr-FF）和共用反向引物AGAAAAGG ACAACATTGAGA（Fgr-R），引物位置见图1;再利用PCR扩增中引物5?端保守性差的特点，将来源于农杆菌T-DNA的DNA序列ACAGGATTC AATCTTAAGAAACTTTATTGCC（31 bp）添加至非香型正向引物的5?端，即ACAGGATTCAAT CTTAAGAAACTTTATTGCCCTGGTAAAAAGATTATGGCTTCAG（Fgr-NF），构成香味检测的三引物功能标记。该标记（Fgr-NF、Fgr-FF和Fgr-R）在香味纯合植株中，能扩增出115 bp特异条带;在非香型植株中能扩增出156 bp特异条带;在杂合植株中能同时扩增出115 bp和156 bp特征条带。新设计的香味标记中，扩增产物无多余条带，且特异条带差异达41 bp，通过琼脂糖凝胶就能准确清晰地检测出水稻香、非香及杂合3种状态，提高了香味检测的准确性和效率。

2.2 水稻香味基因三引物功能标记的应用与验证

2.2.1  不同品种水稻的香味基因检测  为了验证新标记的准确性，采用香味三引物功能标记对30个水稻品种叶片香味基因进行检测（图2），然后采用KOH法和咀嚼法分别对叶片和籽粒的香味情况进行验证。由图2可看出，材料1、2、8等9个品种均扩增出115 bp的香型特征条带，且这9个品种的籽粒和叶片均为香（表1）;材料3、

4、5等20个品种均扩增出156 bp的非香型特征条带，且这20个品种的籽粒和叶片均为非香（表1）;材料11为杂交稻，同时扩增出115 bp和156 bp特征条带，叶片表现为非香，部分籽粒表现为香（表1）;杂交稻的2种表型鉴定结果不一致，由于水稻香味基因为隐性基因[12， 14]，杂合型植株的香味性状发生分离，既有香型，也有非香型。通过基因检测结果和表型验证可发现，新开发香味三引物功能标记准确可靠，能满足香稻品种培育的要求。

2.2.2  水稻不同F2代株系的香味基因检测  利用三引物功能标记对94个单株的叶片香味进行鉴定，结果见图3，编号4、12、13等23个单株均扩增出115 bp的特征条带，且这23个单株的籽粒和叶片均为香（表2）;编号2、7、8等27个材料均扩增出156 bp的特征条带，且这27个单株的籽粒和叶片均为非香（表2）;编号1、3、5等44个单株同时扩增出115 bp和156 bp特征条带，这44个单株的叶片表现为非香，部分籽粒表现为香（表2）。94个F2代单株是‘湘晚籼13号（香）与‘谷梅4号（不香）杂交植株F1的自交种子，通过三引物功能标记检测，结果发

现香味纯合植株有23株，非香纯合植株有44株，杂合植株有27株，符合1∶2∶1分离比例;并且基因杂合植株叶片不香，部分籽粒香的特征，进一步表明香味基因是典型的隐性基因。

3  讨论

水稻Badh2基因的缺失和变异导致2-AP积累，产生香味，但外界环境如温度、土壤等因素影响着水稻香味的浓度[15， 26]。魏晓东等[27]在研究遗传与环境对水稻香味形成的影响时发现，除Badh2基因外，气候、土壤、栽培等也会影响水稻香味物质的合成。阳树英等[28]和徐振江等[29]在比较不同地域的香稻品质时发现，温度、光照影响稻米食味品质和香味浓度，特别是灌浆结实期的温度。另外，土壤中的矿物质（如氮、钾、锌、锰、镧等微量元素）含量、水分和有机质含量也影响水稻香味物质的累积[30-37]。温度、土壤、栽培等因素对水稻香味物质浓度的影响，降低了感官鉴定的准确性，增加了香味植株筛选的难度。

自Badh2基因被克隆以来，水稻香味基因的研究和应用也更加深入，BARDBURY等[38]利用Badh2基因第7外显子8碱基缺失和3碱基突变位点，在基因内部设计了4种引物，通过等位基因扩增分析，借助1%琼脂糖凝胶准确地区分香与非香水稻基因型，该法能够同时分析香型水稻基因序列中的单核苷酸多态性、缺失或插入座位，但是四引物明显提高了引物合成的成本，并且在读取结果时需要借助高昂价格的紫外仪。王丰等[39]根据Badh2基因发生的缺失片段设计出分子标记GRFM04，仅通过1对引物就能检验香型材料粤丰B和非香型材料振丰B的F2分离群体，以及其他22份材料的香味基因型，其中香型和非香型材料标记分别为201 bp和209 bp，刚好相差8 bp，因此，电泳检测时必须要借助高毒的8%聚丙烯酰胺凝胶检测。闫影等[40]针对Badh2基因第7外显子处8碱基缺失和3碱基突变特点，开发了四引物分子标记YY5-YY8检测香型和非香型水稻材料，通过2%琼脂糖凝胶结果显示，当扩增产物为583、169 bp时，材料为香型;当扩增产物为591、449 bp时，材料为非香型。与王丰等[39]的标记方法相比，该分子标记方法操作简单，但也需要设计4条引物，并且在读取结果时条带较多，容易出现错乱。徐小龙等[24]根据Badh2基因第7外显子突变设计出四引物分子标记引物M7，分别对香稻‘W香99075和非香稻‘261S等材料进行电泳检验，结果显示，香型和非香型材料分别扩增出780 bp和2100 bp条带，杂合型水稻同时扩增出780 bp和2100 bp条带;孙平勇等[41]根据香味基因序列特征设计1对引物的功能性分子标记E7，通过对10份香稻品种和2份非香稻品种的基因型检测，准确鉴定了Badh2基因显性纯合、隐性纯合和杂合3种基因型，但此方法设计扩增出香型和非香型产物大小分别为267 bp和275 bp，也需要通过8%聚丙烯酰胺凝胶检测，虽然这些方法都各有千秋，但为香味基因的应用提供了技术支持。本研究根据水稻Badh2基因第7外显子突变序列特征，利用PCR扩增中引物5?端保守性差的特点，将31 bp外源DNA序列添加至非香型引物的5?端，构成水稻香味三引物功能新标记;该标记将Badh2基因第7外显子突变类型的非香型和香型特征条带差异扩大至41 bp，仅通过3%无毒琼脂糖凝胶，就可在无多余条带的基础上准确反映待测的类型，香稻中香味基因的纯合、杂合和无3种状态，用时较短，所需仪器简单，方便操作。不仅避免了KOH法和咀嚼法的主观误差，也避免了采用毒性高、耗时长的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，并且唯一的条带更加有助于結果的读取，显著提高了香味植株鉴定的准确性和效率，为优质香稻的培育提供了强有力的技术支持。

標记开发后，育种家们通过香味与抗性、优质等基因标记的结合，培育既有香味还具有抗性好、品质优的水稻新品种。闫影等[42]聚合水稻抗条纹叶枯病基因QSTV-11b和香味基因fgr，结合田间抗性鉴定，育成了香型高抗条纹叶枯病，且高产优质的早熟晚粳新品种类型‘沪香粳151;韦敏益等[43]和李虎等[44]利用fgr基因标记ESP、IFAP、INSP、EAP和抗稻瘟病标记M-Pi5F、M-Pi5R、Pia-F、Pia-R等辅助选择，结合田间农艺性状和抗性鉴定，育成了同时具有抗稻瘟病基因Pi5、Pita、Pia、Pi2和香味基因fgr的丰产性优质香稻‘桂野香占和‘桂香99;李荣田等[45]将香味分子标记筛选和田间选择相结合，培育出茎叶直立、抗倒伏、高产、有香味的水稻新品种‘黑大香1。香味分子标记的开发对香稻资源创制、新品种培育具有重要意义，利用香味分子标记和农艺性状相结合的方法，有望培育更多香型优质高产的水稻新品种材料。

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