桦褐孔菌子实体中三萜类化合物的研究进展

王 艳，苑宏博，董迎迎，李虹佳，赵 宁，辛嘉英,2，张兰威

（1.哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150076；2.中国科学院兰州化学物理研究所，羰基合成与选择氧化国家重点实验室，甘肃 兰州 730000；3.哈尔滨工业大学，化工学院食品科学与工程系，黑龙江 哈尔滨 150076）

桦褐孔菌是一种生物活性优良的药食两用真菌[1]，其自然生长环境主要分布在低纬度地区，如俄罗斯及中国东北部等。国内主要分布在黑龙江大小兴安岭、吉林长白山、内蒙古、山西等地[2]。虽然早在400年前就有关于桦褐孔菌入药的记载，但是有关于桦褐孔菌的深入研究是在上世纪50年代末才开始的[3]。经过了近些年的开发研究，人们发现桦褐孔菌具有多种有利于人体的功能特性，美国、俄罗斯、日本、中国等国都有在进行褐孔菌功能特性的相关研究[4]。目前，关于桦褐孔菌的研究主要分为桦褐孔菌野生子实体及人工培养两方面，因桦褐孔菌对土壤条件、森林类型、共生树种要求较高[2]，故野生桦褐孔菌资源较为有限，桦褐孔菌的人工培养在近些年已成为许多研究人员极为关注的研究方向。桦褐孔菌中包含Fe、Mg、Ca等常量元素在内的无机元素足有22种[5]，这22种无机元素均对人体无毒害作用，在无机元素角度看桦褐孔菌制品具有足够的食用安全性，且通过小鼠急性毒性试验、小鼠骨髓细胞微核试验、Ames试验、小鼠精子畸形试验、大鼠28 d喂养试验及大鼠90 d喂养等试验探究桦褐孔菌的毒性作用，也证实了桦褐孔菌具有食用安全性属实际无毒级[6]。除上述无机元素外，桦褐孔菌中还具有多种功效成分如三萜类化合物、多糖类化合物、多酚类化合物、甾体等物质，其中，桦褐孔菌中的三萜类化合物是桦褐孔菌中的主要功效成分之一，因其具有抗癌、降血糖、抗氧化等功效[7]，而备受国内外医药及食品行业关注。各国学者也一直在探索开发桦褐孔菌三萜类化合物的新功能性。目前，我国的桦褐孔菌开发与利用程度仍较为落后，市场上多数还停留在利用桦褐孔菌菌块泡水饮用阶段，其中的功效成分未被有效利用，但随着对桦褐孔菌三萜类化合物相关研究的进一步深入，桦褐孔菌三萜类化合物产业化的医疗产品与保健食品市场必然会得到大力的开发。故本文综述了国内外对桦褐孔菌三萜类化合物的人工诱导生成、提取分离纯化、结构及功能性研究等内容，以期对桦褐孔菌资源的开发、桦褐孔菌的产业化开发、桦褐孔菌的医疗产品及食用产品的开发提供参考。

1 人工诱导桦褐孔菌发酵高产三萜类化合物

桦褐孔菌的功效很大程度上来源于桦褐孔菌所含的功能性物质，三萜类化合物作为桦褐孔菌主要功效成分之一，具有很高的研究价值。因野外桦褐孔菌资源有限，人工诱导培养桦褐孔菌菌种产三萜类化合物是目前国内外极为关注的研究方向，基于灵芝等药用真菌的诱导培养机制，对桦褐孔菌的诱导培养也在逐渐深入。近年来，国内外研究人员通过实验发现还原桦褐孔菌野外生长条件并添加相关物质也可以使桦褐孔菌中的三萜类化合物产量增加。目前，关于桦褐孔菌三萜类化合物的诱导培养研究现状见表1。

表1 桦褐孔菌三萜类化合物的诱导培养研究现状Table 1 Research status of induction culture of triterpenoids from Inonotus obliquus

可以看出传统的诱导剂如茉莉酸甲酯、脂肪酸、金属离子等物质中，茉莉酸甲酯对桦褐孔菌三萜类化合物的诱导作用较好。桦褐孔菌宿主提取物及植物共生微生物提取物诱导剂中根瘤菌提取物的诱导作用最好。通过上表也可看出，目前桦褐孔菌三萜类化合物诱导实验所测定的多为总三萜或者单种类三萜，对诱导前后三萜类化合物的种类与含量关系测定研究较少。除添加诱导剂外，紫外诱变也可筛选出高产三萜菌株，且可参考其他类似真菌的诱导发酵培养实验，如同属于纤孔菌的粗毛纤孔菌诱导发酵培养试验一样进行诱导剂筛选并复配[12]。

2 桦褐孔菌三萜类化合物提取与分离纯化

2.1 桦褐孔菌三萜类化合物的提取

三萜类化合物的提取原理主要是利用其在不同的有机溶剂中溶解性的差别，进而甄选有机溶剂进行提取。提取方法主要有回流提取法、高压脉冲法、超声提取法等，每种方法的提取效率与三萜类化合物得率都不同。研究人员对提取方法参数进行调整以期提高每种方法三萜类化合物得率，经实验后，采用回流提取法，提取时间为2.5 h、提取溶剂为异丙醇、料液比1:22，回流温度80 ℃，提取三萜类化合物的最佳得率为1.13%[13]。采用超声提取法，提取时间为15 min、提取溶剂为异丙醇、料液比1:30、超声功率300 W、超声30次，提取三萜类化合物的最佳得率为1.06%[14]。采用高压脉冲法，提取时间为20 μs、提取溶剂为75%乙醇溶液、料液比1:30、电场强度50 kV/cm、脉冲数10、提取三萜类化合物的最佳得率为1.18%，且比同采用75%乙醇溶液作为提取溶剂的超声波法、溶剂浸提法提取率高5%和8%[15]。采用回流提取法三萜类化合物得率较高，仪器简单，但提取时间较长。超声提取法提取较为快速，但三萜类化合物得率较低。高压脉冲法能耗低、重复性好、效率高且提取速度快，但设备复杂昂贵[16]。因此，在工业生产及实验室提取时建议根据所有设备及提取目的甄别方法。

为了提高三萜类化合物得率，超声波辅助技术与其它提取方法联用备受关注。经实验人员将仅采用超声波提取法[14]与超声波辅助技术联用双水相体系提取法比较发现，采用超声波辅助技术联用双水相体系提取三萜类化合物得率提高了12.94%[17]。另有研究人员利用超声波辅助技术联用回流提取法提取三萜类化合物，将三萜类化合物得率提高至1.42%[18]。但其未与联用提取法前得率进行对比，故参考价值有限。但仍可以看出利用超声波辅助技术联用其他方法可有效提高三萜类化合物得率，工厂及实验室在选用提取方法时可以进行有效参考，选取合适的辅助与提取技术提取桦褐孔菌三萜类化合物。

2.2 桦褐孔菌三萜类化合物的分离纯化

无论是通过野外子实体还是人工培养菌种提取得到的三萜粗提物成分均较为复杂，未达到可直接利用的纯度，因此，需要对三萜粗提物进行分离纯化才能进行利用。目前，三萜类化合物的分离纯化方法主要有高效逆流色谱法、柱层析反复分离法、大孔树脂吸附法和高效液相色谱法等，其特点见表2。

表2 桦褐孔菌三萜类化合物分离纯化方法表Table 2 Table of separation and purification methods of triterpenoids from Inonotus obliquus

桦褐孔菌三萜类化合物的分离纯化对于桦褐孔菌实验室研究与工业化生产均具有重要意义。其中，大孔吸附树脂吸附法，因其具有不含交换基团、不溶于水、吸附量大、选择性好、吸附速度快、可再生等优点，被研究人员广泛用来进行桦褐孔菌三萜类化合物的分离纯化。其中，AB-8和D101两种树脂常用来进行桦褐孔菌三萜类化合物的分离纯化，研究人员对两种树脂进行了筛选，发现AB-8大孔树脂较D101大孔树脂更适合用于分离纯化桦褐孔菌三萜类化合物[21]，而后有研究人员对AB-8大孔树脂分离纯化三萜类化合物进行了工艺优化，其分离纯化纯度可达85.13%，与纯化前相比总三萜量提高了2.04倍[23]。为了寻找更适合进行桦褐孔菌三萜类化合物分离纯化的树脂，研究人员扩大了筛选范围对5种常用的大孔吸附树脂进行了筛选实验，实验结果也证实了AB-8树脂是目前更适宜进行桦褐孔菌三萜类化合物分离纯化的大孔吸附树脂[24]。

除了大孔树脂吸附法，在实验室及工业生产过程中色谱法也是分离纯化三萜类化合物常用且高效的方法[25]。尽管高效液相色谱及高效逆流色谱提取三萜类化合物的纯度较高，但是因为大孔吸附树脂分离纯化法具有工艺简单、操作简便、成本低、产率高等优点，后者应用更加广泛。对于纯度要求较高的实验室研究选用高效液相色谱及高效逆流色谱法比较合适，对于成本要求更高的工厂应用则选用大孔吸附树脂分离纯化法更为合适。目前，关于桦褐孔菌三萜类化合物分离纯化的研究较少但仍在持续进行，希望可以筛选出更多的桦褐孔菌三萜类化合物分离纯化法，根据不同目的去选择相应的分离纯化方法是推动桦褐孔菌三萜资源开发的重要一步。

3 桦褐孔菌三萜类化合物结构研究

桦褐孔菌中三萜类化合物是由多种三萜类化合物组合构成的，目前，对于桦褐孔菌三萜类化合物结构的研究主要集中在其三萜类化合物萜组成成分方面，研究桦褐孔菌三萜类化合物的结构与功能特性之间的关系是后续亟需深入研究的部分。对桦褐孔菌三萜类化合物结构的研究方法主要有化学法和波谱法。波谱法（紫外吸收光谱法UV，红外吸收光谱法IR，核磁共振波谱法NMR，质谱法MS）因具有样品用量少，精确度高以及分析时间短等优点，已逐步取代化学法，广泛应用于有机化合物的结构鉴定。

3.1 桦褐孔菌三萜化合物的结构研究现状

关于桦褐孔菌的结构研究，目前多通过分离纯化后，对分离物的波谱数据采用红外光谱、核磁共振等技术进行分析，从而研究其结构。目前，关于桦褐孔菌三萜类化合物的结构研究尚处在起步阶段，与桦褐孔菌多糖的结构研究相比较为落后，对于分离出的三萜类化合物功能性研究也较为不足。各桦褐孔菌三萜类化合物的功能活性与其结构间的关系也尚未被探明，有研究显示茯苓皮中的羊毛甾烷型三萜的16位或15位羟基、BC环上的双键均与其对肿瘤细胞的毒性密切相关[26]，桦褐孔菌中也含有多种羊毛甾烷型三萜，其结构与功能性的关系可能与茯苓皮羊毛甾烷型三萜类似。桦褐孔菌醇是一种羊毛甾烷型三萜，且是桦褐孔菌所含三萜类化合物中研究较早的，也是三萜类化合物中功能活性研究较为明确的。有学者根据灵芝中的灵芝酸A和灵芝酸H抑制癌细胞的增殖作用与其3位、7位和15位的羟基取代有关，推测出如果化学修饰桦褐孔菌醇7位、15位和16位上的羟基也可增加桦褐孔菌醇的抗肿瘤作用[27]。目前，桦褐孔菌三萜类化合物结构研究还停留在结构鉴定阶段，其结构与功能特性的关系研究还处在起步阶段正在等待科研人员的继续探索。

3.2 桦褐孔菌三萜类化合物的结构鉴定

国内外研究人员采用了不同的方法对桦褐孔菌三萜类化合物进行了结构鉴定，目前，对桦褐孔菌三萜类化合物的结构鉴定见表3。

表3 桦褐孔菌三萜类化合物结构鉴定表Table 3 Structure identification table of triterpenoids from Inonotus obliquus

表中结构鉴定结果不同可能与其分离条件和方法选择有关，从表中可以看出分离手段较少则所鉴定出的三萜类化合物种类也相应会较少，因此，在进行结构分析时需要将桦褐孔菌三萜提取物采用多种分离方法进行分离，故建议在进行桦褐孔菌三萜类化合物结构鉴定时根据已有条件尽量选用多种分离手段。

4 桦褐孔菌三萜类化合物的功能性

桦褐孔菌三萜类化合物的功能性研究是桦褐孔菌研究的重要组成部分，桦褐孔菌资源的开发依赖于其功能性的相关开发，对桦褐孔菌三萜类化合物的功能性进行透彻的体外实验及动物实验乃至临床试验对桦褐孔菌资源的开发、桦褐孔菌的工业化生产具有重要意义。

4.1 抗癌作用

桦褐孔菌三萜类化合物的抗癌功效一直是桦褐孔菌三萜类化合物功能性研究中的热点，有报道显示桦褐孔菌提取物对正常细胞无毒性作用，相比较其他抗癌药物可能会有更小的副作用[32]。桦褐孔菌三萜类化合物对于抗癌的作用主要是从抑制癌细胞增殖作用和使癌细胞凋亡作用两个方向进行实验的[33]。有实验发现桦褐孔菌三萜类化合物浓度达到250 μg/mL时即可明显抑制癌细胞的增殖，并随着剂量加大其抑制性也随之增加，其胞外三萜类化合物对癌细胞增殖的抑制性明显高于胞内三萜类化合物[30]。有研究人员在其研究上用其他癌细胞进一步进行了验证，证实了其结论并发现桦褐孔菌胞外三萜类化合物含量高于胞内三萜类化合物含量[34]。因此，桦褐孔菌胞外三萜类化合物在抗癌领域更有进一步研究的价值。为了研究桦褐孔菌三萜类化合物对癌细胞的凋亡作用，有研究通过桦褐孔菌三萜类化合物诱导不同p53状态的人肺癌细胞，发现其可使人肺癌细胞裂解从而使其凋亡，以达到抗癌作用[35]。有实验发现桦褐孔菌三萜类化合物中的抗癌作用物为白桦脂醇、栓菌酸、桦褐孔菌醇和羊毛甾醇[36]。为了更加贴近实际应用效果，有研究人员对桦褐孔菌三萜类化合物抗癌作用与抗癌药物紫杉醇做了对照，实验结果表示桦褐孔菌三萜类化合物对人宫颈癌细胞、人结肠癌细胞、白血病肿瘤细胞及小鼠淋巴细胞均有较强的细胞毒性[37]。总的来说，体外实验证明了桦褐孔菌三萜类化合物具有一定的抗癌功能，但是活体实验的缺乏使其抗癌性能的作用效果并不明确，未来需要研究人员进行动物实验乃至临床试验才能准确验证评估桦褐孔菌三萜化合物的抗癌功能性。

4.2 降血糖作用

据估计，2045年，全球糖尿病患者人数将增至7亿[38]。糖尿病药物的研发是目前医疗行业的热点项目，也是广大糖尿病患者的期望福音。市面上许多商家对桦褐孔菌冠以“天然胰岛素”之名，有研究表示桦褐孔菌对Ⅱ型糖尿病大鼠具有降血糖作用[39]，但桦褐孔菌资源开发程度较低，其降血糖作用也只处在保健或者辅助治疗阶段，只有对桦褐孔菌的功效物质进行更准确的降血糖功能实验之后才能够更好地将桦褐孔菌资源应用于糖尿病的治疗当中。研究人员根据市面上的降糖药物阿卡波糖的降糖原理——抑制α-葡萄糖苷酶与α-淀粉酶活性使进食的碳水化合物分解成葡萄糖的时间延长[40]，对桦褐孔菌三萜类化合物的α-葡萄糖苷酶抑制率与α-淀粉酶抑制率进行了实验，实验发现其对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶均具有一定的抑酶活性，其中，白桦脂酸对α-葡萄糖苷酶的活性抑制IC50值为0.26 mg/mL，显著低于降糖药物阿卡波糖的活性抑制IC50值（0.37 mg/mL），桦褐孔菌萜D对α-淀粉酶的活性抑制IC50值为7.86 mg/mL，显著低于降糖药阿卡波糖IC50值（10.51 mg/mL）；其作用机制为桦褐孔菌三萜类化合物对α-葡萄糖糖苷酶产生了竞争性抑制，对α-淀粉酶产生了非竞争性与竞争性抑制混合抑制[41]。体外实验的成功也希望可以为后续的桦褐孔菌三萜类化合物降血糖动物实验及开发新型抗糖尿病药物提供新的思考。

4.3 抗氧化作用

在日常生活中人体会持续产生氧化性自由基，当自由基在体内积累过多时，就会加速人体的衰老甚至引发心血管疾病。目前，关于桦褐孔菌三萜类化合物的抗氧化相关试验较为匮乏，基本停留在体外抗氧化试验上，通过体外实验发现桦褐孔菌三萜类化合物可清除DPPH、ABTS、超氧化物和过氧自由基，并随着其浓度的升高其清除自由基能力也随之升高[17,42]，体外实验的结果证明了桦褐孔菌三萜类化合物具有一定的提高抗氧化能力作用。有研究人员对于氧化损伤小鼠模型做了相关实验，发现桦褐孔菌对氧化损伤具有一定保护作用，功效成分为桦褐孔菌醇[43]。目前，关于桦褐孔菌的抗氧化小鼠实验较少且均是腹腔给药，相对较为偏重于医疗行业的应用，其以食品方向进行的喂药小鼠实验较少[44−46]。因此，在桦褐孔菌三萜类化合物抗氧化能力小鼠实验中应进行喂药供药，以期更好地应用于食品行业。近年来我国针对脑卒中所开发的药物丁基苯酞就可有效提高细胞抗氧化活性，桦褐孔菌的抗氧化作用研究对于脑卒中开发新药及医美行业抗衰老等都具有很大的研究价值。

4.4 其他作用

桦褐孔菌三萜类化合物的功能性作用仍然处于不断开发阶段，研究人员们基于桦褐孔菌的免疫调节、抗炎、抗氧化和抗凋亡性能，正在拓展研究桦褐孔菌三萜类化合物的一系列新的功能特性，如神经保护作用、抗脱发作用、抑制一氧化氮合成逆转内毒素和肿瘤坏死因子引起的低血压、和肝保护作用[31,47−49]。桦褐孔菌也在从泡水饮用的保健食品一步步向治疗疾病的医药产品进发，研究人员致力于将桦褐孔菌不同的功效成分应用于治疗不同的疾病，并将不同的功能特性应用于预防各类疾病。桦褐孔菌三萜类化合物作为桦褐孔菌中含量最多的脂溶性化合物，提取价值高，功能特性优越，桦褐孔菌三萜类化合物的研究开发对推动桦褐孔菌的产业化、应用化、规模化将起到重要作用。

5 结语与展望

桦褐孔菌三萜类化合物具有抗癌、降血糖、消炎、抗氧化等多种功效，并基于以往研究的成果正在不断研究、开发和应用于其他保健与医疗场景，对未来的保健品、药品与食品行业的市场应用具有一定的启发。因野生桦褐孔菌资源有限，大规模的桦褐孔菌三萜类化合物产品生产将更加依赖于人工培养桦褐孔菌，为促使桦褐孔菌资源的规模化发展，今后应系统化的对人工诱导培养出的桦褐孔菌菌株进行后续相应的提取、分离纯化和功能特性的相关实验并与野外子实体相关实验数据进行比对，并在实验室及工厂化两个方面去进行提取及分离纯化的技术筛选进而推动桦褐孔菌的规模化和产业化。

对桦褐孔菌三萜类化合物今后的研究方向，可以从以下几个方面进行：a.目前桦褐孔菌三萜类化合物的诱导性高产研究多与单一刺激物或外源因子有关，复配诱导剂的有关研究相对较少，并可将复配诱导剂与物理诱变法相结合以期提高三萜化合物产量；b.目前缺少桦褐孔菌三萜类化合物对人体的作用研究，基本停留在体外实验阶段，动物实验也较少，体外实验的成果在人体上效果如何，是否有不良反应及禁忌尚未可知，应增加动物实验比例并随进度进行临床试验；c.尚未探明桦褐孔菌三萜类化合物的结构与其功能活性的关系，探明关系后多展开关于桦褐孔菌单体三萜化合物的功能性实验及化学修饰，以期增加其功能性，推广桦褐孔菌开发。

桦褐孔菌作为尚未广泛应用于医疗及食品行业的新兴研究真菌，与灵芝等真菌不同，尽管已经过了科研人员几十年的不懈研究，但尚有许多作用机制尚未明确，大多数研究目前还停留在应用方面，对作用机制的研究较少。作用机制的明确对于桦褐孔菌的医用食用安全性研究将起到很大地促进作用，并从临床角度齐头并进，才能更好地开发利用桦褐孔菌资源，为人类的生活质量与疾病治疗做出贡献。