纤维素的微生物降解研究进展

李 静，李明源，王继莲，张 甜，周 茜

（喀什大学生命与地理科学学院，叶尔羌绿洲生态与生物资源研究高校重点实验室，新疆帕米尔高原生物资源与生态重点实验室，新疆 喀什 844000）

纤维素是由葡萄糖以β-1,4糖苷键连接而成的线性链多糖[1]，结构紧密、排列有序，具有高结晶度和难溶性等特点[2]，是植物细胞壁的主要组成成分（图1）。纤维素类物质是世界上年产量最多的二次资源[3]，每年通过光合作用合成的有机物约有1×1011t，而纤维素就占50%，它们的再利用对社会的可持续发展和环境保护具有重要意义[4]。

图1 纤维素结构示意图[5]Fig.1 The structure of cellulose[5]

纤维素的预处理是目前制约生物质资源高效利用的技术瓶颈之一。物理方法可以有效降低纤维素的结晶度，包括破碎、高温热解、微波处理和高能辐射等方式，具有操作简单、污染少的优点，但同时能耗大，成本高。化学方法操作繁琐程度较低，短时间就可达到降解效果，方式主要包括酸降解、碱降解、有机溶剂预处理和氧化预处理等。但所需试剂浓度较高，且后续需进行pH调节，生成的化学残留物也会对环境造成污染，因此处理过的酸碱必须进行回收处理[6]。而微生物预处理是利用高产纤维素酶降解菌对其进行酶解，具有环保、专一性强、处理成本低、反应条件温和、能耗低等优点，备受科研人员关注[7−8]。研究者们相继开展了纤维素酶生产菌的选育及降解特性研究，得到了一批宝贵的菌种资源[9]。本文总结归纳了纤维素降解菌的筛选方法和研究策略，探讨了各策略的优势特点和应用价值，并阐释了纤维素的微生物降解机理，对未来如何进一步高效利用纤维素进行了展望，以期为纤维素类物质的降解提供进一步理论支撑，促进二次资源的综合利用。

1 筛选单一菌株降解纤维素

环境中存在着丰富的纤维素降解菌，主要包括真菌、放线菌及细菌等。它们的类群庞杂，相互协调，但绝大多数难以进行人工培养。目前已分离200多种，主要来源于枯腐树叶或衣服、秸秆还田的土壤、反刍动物粪便等，多使用单一碳源（滤纸条或羧甲基纤维素钠CMC-Na）进行富集培养[10−11]。由表1可见，降解菌种主要包括青霉属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）、链霉菌属（Streptomyces）、假单胞菌（Pseudomonas）、芽孢杆菌（Bacillus）等，以真菌居多，不同菌种对底物的降解效率参差不齐。

表1 单一菌株的纤维素降解特性Table 1 Characteristics of cellulose degradation activity of single strain

纤维素分子间主要靠氢键连接，键能相对较弱，其降解主要靠微生物产生的纤维素酶（包括外切β-1,4葡萄糖苷酶、内切β-1, 4葡萄糖苷酶和β-葡聚糖苷酶）破坏其氢键和β-1, 4糖苷键，将其多结构变为单结构。但纤维素酶活力受到诸多因素的影响，与培养温度和培养时间密切相关，温度过高会造成菌株提前失活[12]，微生物培养基的pH、营养成分比例、接种量等也会对酶活力产生明显影响，影响降解率。而相关研究报道证明通过向培养基中添加一定量的Fe2+和VB12等附加因子，可以起到稳定酶空间构象及提高微生物代谢效率的作用[20]，有效提高纤维素降解率。此外，培养基中可添加适宜的产酶诱导物也可以提高纤维素酶产量，加速纤维素降解。槐糖是已报道诱导力最强的产纤维素酶诱导物，但大规模生产不具备经济可行性。而以稻草粉代替槐糖作为碳源和诱导物，采用固体发酵法优化绿色木霉的产酶条件，纤维素酶活力得到有效提升[21]。

近年来，环境耐受性良好的高效降解纤维素菌株也被逐步发掘。某些冷适应降解菌的产酶条件经优化后在低温下可保持高效产酶能力。放线菌Clavibacter michiganensisCF11在低于10 ℃、pH为6.5、培养时间为10 d的条件下纤维素酶活力显著提升[22]。而一些耐高温纤维素酶菌株具有高温偏好性，热稳定性强，在高温环境下的纤维素降解能力较强[23]。如解淀粉芽孢杆菌Bacillus methylotrophicusY3-2在55 ℃条件下，不仅能高效降解纤维素，还具有抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等病原菌的能力，具有潜在应用前景[24]。但超高温好氧发酵技术过程中会流失较多的营养成分，如何在高效降解和保持较多的营养成分之间找一个平衡点，有待深层次研究[25]。

2 微生物协同降解纤维素

单一菌株生成的纤维素酶种类相对单一，产酶能力薄弱，降解能力有限。1950年，Gilligan[26]首次发现木霉所产的纤维素酶可通过协同作用，实现对纤维素的高效降解。微生物协同降解的优势在于产酶种类多、耗时少、降解覆盖率高、针对性强[27]，但对培养条件、培养基成分、比例等的要求相对严格。工业生产中，常利用微生物的协同作用达到降解纤维素作物的目的[28]。

2.1 筛选复合微生物菌系

直接从自然界筛选的天然复合菌群，基于微生物间的协同作用能有效增强纤维素降解速度，不仅拥有健全的酶系，还可以将不同pH的培养液缓冲到中性，更适合菌系生存。崔宗均等[29]采用酸碱反应互补原则，在传代时重新优化组合驯化出的复合菌系MC1可在72 h内将滤纸和脱脂棉等较纯的纤维素材料完全降解，对麦秆、锯末等材料也有较强的降解能力。

复合体系中微生物产生的纤维素酶可降解纤维素生成葡萄糖，起到为菌供能、促进增殖等作用，多组分酶体系在降解过程中互补互利，共同完成降解过程。而复合菌系的构建增加了酶的环境适应性和功能稳定性，弥补了单一菌种的纤维素酶种类不全和纤维素酶配比不协调等缺点，从而提升降解速度。因此可以说，各组成菌之间、组成菌与纤维素酶、各酶与酶之间的协同和拮抗作用，是保持复合菌系稳定的重要机制。即使混入其它杂菌，也很难将这个平衡系统破坏。

复合菌系虽然在降解效果上优于单一菌株，但降解过程中出现的不确定因素也较多，如微生物群落和代谢类型不明确、高温或低温环境中部分酶系易失活、菌系的组成和结构会因培养条件的差异而改变等。因此，要想达到快速、低成本降解纤维素的目的，高效降解菌的筛选还存在一些亟待解决的瓶颈问题：a.明确复合菌系中菌株组成类别，进而准确判断菌株习性，构建最优培养条件；b.深入解析各酶组分之间的重要协同作用关系；c.解析复合菌系中的代谢调控；d.增强对环境耐受性的复合菌系的研究。现阶段可对菌株培养条件（温度、pH、培养时间等）进行变量-非变量研究，观察纤维素降解效率及纤维素酶活峰值的变化，从而确定菌群的最优培养条件[30−31]。或重新组合已有的复合菌群和功能菌群，检测、对比新复合菌系的降解效率、结构稳定性及功能性，从而进一步明确复合体系中各组分间的协同作用关系。此外，还可联合生物工程技术构建基因工程菌，将难培养的微生物中的纤维素酶编码基因克隆到大肠杆菌或酿酒酵母上进行表达，以期获得产率更大、酶系更完整的高活性降解菌。而通过分子生物学技术提取复合菌群的微生物总DNA，从构建的基因组文库中筛选高产纤维素酶基因，也可提升降解菌系的结构和功能分析效率。

2.2 优化组合纯培养菌株

将单一高活性产酶菌株混合培养，基于不同微生物类群的优化组合可以弥补菌种间的性质差异，所构成的完全酶系可充分发挥各酶系间的协同作用，综合提高酶活性，最大限度发挥纤维素降解潜力，毫不逊于直接筛选到的复合菌系（表2）。多数学者对霉菌的组合研究较多[32]，对细菌和放线菌的协同作用鲜见报道。细菌的基因无内含子，可直接克隆目的基因，方便构建高效纤维素酶工程菌[33]。而放线菌作为土壤微生物的重要组成部分，参与了大部分高分子聚合物的降解，还可以产生具有抑制杂菌生长的抗菌素[34]。因此，构建细菌与放线菌的复合菌系具有广阔的研究前景。此外，菌株的培养环境也会深刻影响降解效果，原位生长环境的模拟能显著提升其降解效果。

表2 组合菌株的纤维素降解特性Table 2 Characteristics of cellulose degradation activity of mixed strains

针对分离到的不同单一菌株，总结其相互间的拮抗活性、酶种类和代谢产物，将具有互补差异的几种高酶活菌株进行复配，介导菌株之间的协同作用可起到提高菌系的降解能力和稳定性目的。同时此类复合体系每个菌株的特性明确，在实际应用中能较好地控制其活性，可操作性强。但缺陷在于优化组合单一菌株的过程相比天然复合菌系繁琐复杂。另外需注意的是，并不是所有混合菌的发酵一定比单菌株发酵能力强，因复合菌系之间可能存在竞争或拮抗作用，不利于菌株的生长和产酶。因此，在进行不同组合的菌株培养时，要充分考虑菌株间的拮抗作用、物种组成和比例、菌株的生长周期和整体酶系的稳定等因素[45]。

3 微生物降解纤维素机理

微生物直接通过胞吞方式将纤维素等大分子物质转移至细胞膜内进行代谢是很难实现的，因此，其对纤维素的降解主要靠分泌至胞外的纤维素酶氧化分解。由于纤维素结构的复杂性，其确切的降解机理至今尚无定论。目前被大家普遍接受的主要有3种理论[46]，分别是C1-CX假说、协同理论和原初反应假说。

3.1 C1-CX假说

此假说认为在纤维素降解过程中，纤维素酶与各个酶或物质要依据一定的步骤顺序才能完成整个水解过程[47]。相关研究表明，需要C1酶（外切β-1,4葡萄糖苷酶）、CX酶（内切β-1, 4葡萄糖苷酶）和CB酶（β-葡聚糖苷酶）同时存在才能将天然纤维素水解为葡萄糖。如果在降解结晶纤维素时首先加入C1酶，反应过后除去C1酶的同时再加入CX酶，则反应过程无法完成。根据C1-CX假说，先是结晶纤维素在C1酶的作用下将已形成结晶结构的纤维素链断裂，使长链分子的末端脱离，形成非结晶无定型纤维素或可溶性低聚糖，从而导致纤维素链易水解。接着CX酶作用于非结晶无定型纤维素或可溶性低聚糖，产生纤维二糖，最后在CB酶的水解作用下生成葡萄糖（图2）。

图2 C1-CX假说理论[48−49]Fig.2 The C1-CX hypothesis theory [48−49]

C1酶可作用于纤维素的结晶区，使之转变为可被CX酶作用的形式。但该学说没有很好地解释C1酶的作用机理。有学者对其提出了种种推测及猜想，如C1酶可能作用于连接纤维素分子间的氢键、纤维素分子中的β-1, 4糖苷键、其它一些不规则的键或薄弱键等，但都没有得到证实[50]。CX酶在水解过程中起着举足轻重的作用，在一定程度上影响着纤维素大分子水解为纤维二糖的程度，可以用来表征纤维素酶降解纤维素的能力。C1酶和CX酶对纤维素的水解作用是分阶段协调的，C1酶只起到转化纤维素的结晶区但不水解的作用，而CX酶可将部分无定型纤维素水解为可溶性产物。

3.2 协同理论

协同理论是3个理论中接受度最高的理论[51]，其降解过程也是由CX酶、C1酶和CB酶3种酶协同完成[52]。其中CX酶的作用是可以给C1酶和CB酶创造酶切位点，再通过水解作用，作用于β-1,4糖苷键，长链寡糖被裂解为短链寡糖，此时一些带有非还原性末端的纤维素分子就会显现出来。最后，C1酶作用于这些带有非还原性末端的小分子纤维素末端，使纤维二糖分子脱下，再在CB酶的水解作用下水解为葡萄糖分子[53]（图3）。Wood[54]发现赤木霉Trichoderma reesei和青霉菌Penicillium funiculosumde产生的纤维素酶在水解微晶纤维素和棉纤维时具有协同性。这种现象可能是由于两种纤维素酶底物的立体特异性不同所致。在协同过程中，每种纤维素酶作用于两个不同的非还原性链末端中的一个。当一种纤维素酶切断一种非还原链末端的一个纤维二糖单元时，另一种非还原链将暴露出来，并且具有不同底物立体特异性的第二种纤维素酶将切断纤维二糖单元。在这个过程中，这两种酶的协调可以解释协同效应。而在晶态几丁质降解过程中，通过几丁质降解酶系的内外协同，促进了外切几丁质酶在几丁质纤维上“持续奔跑”的耐力，进而增强昆虫在蜕皮过程中表皮的快速降解[55]。

图3 协同作用降解纤维素示意图[56−57]Fig.3 Schematic diagram of synergistic cellulose degradation[56−57]

与C1-CX假说不同的是，在协同理论中，纤维素酶的顺序没有固定性和单一性。由于每种纤维素酶组分在水解过程中的确切作用还不清楚，纤维素酶的类型也没有严格的区别。因此，虽然协同理论可以解释大多数纤维素的降解过程，但对起始反应是如何开始的及天然纤维素结晶区的降解机制尚不能完全阐明[58]。

3.3 原初反应假说

原初反应是一个无序反应，最早是在褐腐菌的水解研究中提出的。褐腐菌菌丝处于靠近次生木质细胞壁的S3层，在降解纤维素过程中菌丝可产生降解剂，扩散到S2层，从而导致扩散性腐烂（图4）。当褐腐菌开始降解纤维素时，机械强度急剧下降，在此过程中只有少量的重量损失和少量的还原糖生成[59]，这与纤维素酶水解过程中产生的聚合度降低而生成的还原糖含量增加的变化明显不同。因此Coughlan[60]提出原初反应可以改变纤维素的结晶状态，更有利于纤维素的水解。褐腐菌的独特之处在于，当木材完全降解时，木质素很少被降解，这有利于纤维素和半纤维素的快速解聚。鉴于褐腐菌在降解天然纤维素方面的独特性，有学者推测，褐腐菌可能存在一种特殊的非酶木材降解系统，其中一小部分物质可进入S2解聚纤维素[61]。

图4 木质细胞壁模型Fig.4 Wood cell wall model

另外霉菌在降解时首先会进入纤维细胞壁里面，通过CX酶和C1酶的协同作用降解纤维素。而褐腐菌不含C1酶，CX酶的作用可能只打开一小部分的糖苷键，能降低纤维素的强度，削弱纤维的表面，所以只能看到机械强度的下降等物理变化，其他变化很小，比如其还原糖含量用还原糖分析方法则无法测出。

4 展望

不同菌种生成的纤维素酶之间可能存在某种程度的拮抗作用，从而影响纤维素降解效率。单一菌株易培养、易获取，但酶活性较低，降解不彻底。而多种微生物协同作用在降解中表现出的优势更明显，降解效果更理想，尤其是复合菌系的环境耐受性和稳定性，对纤维素的降解意义重大。但天然复合菌系和优化组合单一菌株的各方面条件相对严格，因此筛选过程中还需注重培养环境的优化。同时，联合基因工程组学，通过分子生物学技术分离纤维素酶编码基因，促进基因表达，包括排除对阻遏敏感的操纵基因、提高转译效率和将基因连到强启动子上等，都可有效改善纤维素酶稳定性，达到提高降解率目的[63−64]。

天然纤维素在降解过程中涉及到的能量变化、新陈代谢复杂多变，具体的生物降解过程尚不完全明确。因此，仍需进一步探究纤维素酶类的不同组分和小分子活性物质之间的作用，从酶学、动力学等多个角度综合揭示纤维素的降解机理。待深入阐明其降解机制过后，就可以实现菌群的人工调控，基于理论分析和应用研究的有机结合，使纤维素酶的水解达到极致，实现纤维素作物的最大限度利用。总之，实现纤维素的微生物降解和资源化利用，是将闲置纤维素类作物变废为宝、保护环境、缓解世界能源危机、推动绿色可持续发展的重要手段。