乳果糖对失血性休克大鼠急性肺损伤的作用及机制

郑强 唐勇 周程继 谷子 刘世平

1成都市第二人民医院急诊科（成都617000）；2川北医学院附属医院急诊科（四川南充637000）

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）、多器官功能衰竭（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）是创伤失血性休克（hemorrhagic traumatic shock，HTS）晚期死亡的主要原因，而创伤失血性休克早期即可出现ALI［1］。氢气是自然界含量丰富、易得、廉价、储存简单及方便的一种分子量极小的气体，它可以自由并快速地在组织间穿梭，从而加快氢分子与细胞内分子的生化反应［2］。最新国内外研究［3-6］发现，氢气对脑、肠、肾、脊髓等器官通过抗氧化、清除氧自由基等方式，对于缺氧缺血及再灌注损伤具有良好的保护作用。乳果糖是一种人工合成的双糖，可被定植在胃肠道的菌群分解，产生大量的氢气，氢气快速进入组织，通过抗氧化等方式发挥组织保护作用［7］，但具体机制尚不清楚。因此本研究推测在失血性休克动物模型中，乳果糖可通过动物模型胃肠道的菌群分解产生氢气，氢气快速进入组织发挥抗氧化等作用，抑制炎症因子的释放，进而对急性肺损伤发挥保护作用。故本研究拟采用乳果糖灌胃干预失血性休克大鼠模型，探讨乳果糖对模型急性肺损伤的保护作用及其机制，从而为临床干预创伤失血性休克提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物来源 雄性SD 大鼠由成都达硕实验动物有限公司提供。

1.1.2 试剂与设备 IL-6、IL-1β 试剂盒由武汉六合生物技术有限公司提供；SOD、MDA、MPO 试剂盒由南京建成科技有限公司提供；抗兔HMGB1 单抗购自美国Santa 公司；抗羊二抗购自上海基因科技有限公司。以上标本的检测及实验设备均按照操作说明书进行并严格遵守成都天府生命科技园各实验室标准操作规程。

1.1.3 伦理审核 川北医学院附属医院及成都市第二人民医院科研委员会批准了所有的研究方案。

1.2 方法

1.2.1 建模 选用250 ～300 g 的雄性SD 大鼠，使用1%戊巴比妥钠30 mg/kg 腹腔内注射麻醉，固定，碘伏消毒，外科手术分离左右股动、静脉并置管，股动脉连接三通管后接压力转换器（Pclab-530C生物医学信号采集系统）、计算机行持续血流动力学监测和抽血，股静脉用于输液。经股静脉缓慢抽血放血30 min，使平均动脉压（MAP）逐渐降至35 mmHg，并维持60 min，在90 min 时给予生理盐水复苏，使MAP 控制在（50±2）mmHg，维持60 min。150 min后，以血液回输及生理盐水复苏，使MAP 控制在≥80 mmHg，并维持120 min。270 min（复苏成功）后处死，采集血液及肺组织。

1.2.2 分组 失血性休克模型制备前60 min，先分为乳果糖预灌胃组即实验组2（10 只）：在模型制备前60 min给予乳果糖0.25 g/kg（稀释到0.75 mL/kg）灌胃。将实验组2 及未进行乳果糖预灌胃处理的SD 大鼠同时麻醉，左右股动静脉置管成功后再将未进行乳果糖预灌胃处理的SD 大鼠分为三组：假手术组即空白组（10 只）：仅作置管；生理盐水复苏组即对照组（10 只）：在MAP 降至35 mmHg时等体积生理盐水灌胃；乳果糖治疗组即实验组1（10 只）：在MAP 降至35 mmHg 时给予乳果糖0.25 g/kg（稀释到0.75 mL/kg）灌胃。四组实验动物置管成功后制备失血性休克模型。

1.2.3 标本收集及处理 （1）在实验期间，持续监测生命体征（Pclab-530C 生物医学信号采集系统）。（2）在0、30 及270 min 分别测定血气和乳酸值（ABL90 血气分析仪）。（3）Western blot 法检测270 min 肺组织高迁移率族蛋白B1（high-mobility group box 1，HMGB1）行聚丙烯酰胺凝胶电泳：将目标蛋白移至硝酸纤维膜上，5%脱脂奶粉封闭，PBS 洗膜后，一抗（抗兔HMGB1 单抗）4 ℃过夜，洗膜后加入二抗（抗羊二抗），37 ℃孵育1 h，用化学发光剂避光反应，将硝酸纤维素膜放至暗室中曝光显影。以β-actin为内参照，目标蛋白与其相比进行半定量分析；Elisa 法检测270 min 血IL-6、IL-1β。（4）270 min 取肺组织一部分用10%甲醛溶液固定24 h，逐级乙醇脱水、二甲苯浸泡、浸蜡、石蜡包埋、切片、附贴、HE 染色后由我院病理科2 位有经验的病理学医生采用双盲法对每个标本进行分析。（5）270 min 取5g 肺组织碾磨并生理盐水定量稀释后用比色法检测超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、TBA法检测髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）。

1.3 统计学方法 计量资料的数据用均数±标准差表示，均数间差异比较用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。所有统计均采用SPSS 25.0 软件包进行分析。

2 结果

2.1 基本实验资料 0 min MAP:（130.0±15.7）mmHg，30 min MAP：（35.0 ± 1.3）mmHg，90 min MAP：（50±1.8）mmHg，270 min MAP：（112±13.8）mmHg。符合实验失血性休克各阶段建模要求。见图1。

图1 失血性休克模型MAP 和心率电脑采集图（Pclab-530C 生物医学信号采集系统）Fig.1 MAP and heart rate computer acquisition map of hemorrhagic shock model（Pclab-530c biomedical signal acquisition system）

2.2 空白组、对照组、实验组1 及实验组2 动物模型血气及乳酸值分析 在270 min 时，对照组PO2值明显低于空白组、实验组1及实验组2（P＜0.05）。其余动脉血气分析及乳酸值各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 空白组、对照组、实验组1 及实验组2 血气及乳酸值Tab.1 Blood gas and lactic acid values of blank group，control group，experimental group 1 and experimental group 2 ±s

表1 空白组、对照组、实验组1 及实验组2 血气及乳酸值Tab.1 Blood gas and lactic acid values of blank group，control group，experimental group 1 and experimental group 2 ±s

注：在225 min 时，对照组 分别与空白组、实验组1 及实验组2 比较Po2，*P ＜0.05

pH Po2（mmHg）Pco2（mmHg）HCO3-（mmol/L）碱剩余（mmol/L）乳酸（mmol/L）时间（min）0 30 270 0 30 270 0 30 270 0 30 270 0 30 270 0 30 270空白组7.39±0.02 7.27±0.04 7.30±0.02 98.7±2.4 83.6±3.1 95.5±4.7 41.5±1.6 31.7±0.7 38.7±3.1 23.5±1.7 15.2±1.4 18.7±1.2 3.1±0.3-15.8±1.6-5.8±0.6 1.7±0.2 13.2±1.7 7.3±0.5对照组7.41±0.03 7.22±0.03 7.26±0.03 96.8±3.5 78.5±5.8 81.6±6.1 42.7±0.5 30.5±1.3 37.5±2.5 23.4±2.3 13.7±2.5 18.0±1.8 3.1±0.4-18.2±2.2-8.2±1.1 1.6±0.3 15.4±2.1 8.6±1.6实验组1 7.40±0.03 7.27±0.03 7.31±0.03 98.8±3.0 86.6±4.9 97.2±3.7 42.1±1.4 30.6±1.2 38.6±1.9 22.2±2.0 15.2±2.2 19.1±2.2 3.0±0.4-15.7±1.6-6.9±1.3 1.5±0.2 13.8±1.9 8.0±1.5实验组2 7.41±0.02 7.28±0.04 7.32±0.03 98.6±2.8 83.1±3.3 96.8±4.2 41.5±1.0 31.8±1.1 38.8±1.5 21.8±2.6 15.1±1.9 19.4±2.5 3.2±0.3-15.5±1.4-7.2±1.1 1.6±0.2 14.0±1.2 8.1±0.9 P 值0.40 0.41 0.28 0.39 0.18 0.04*0.39 0.21 0.29 0.18 0.14 0.09 0.36 0.11 0.18 0.22 0.10 0.09

2.3 空白组、对照组、实验组1 及实验组2 的IL-6、IL-1β、SOD、MDA、MPO 与空白组比较，对照组、实验组1 及实验组2 IL-6、IL-1β、SOD、MDA、MPO 均较高（P＜0.05）；对照组与实验组2、实验组1 与实验组2 分别比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 空白组、对照组、实验组1 及实验组2 IL-6、IL-1β、SOD、MDA、MPOTab.2 Blank group，control group，experimental group 1 and experimental group 2 IL-6，IL-1β，SOD，MDA，MPO ±s

表2 空白组、对照组、实验组1 及实验组2 IL-6、IL-1β、SOD、MDA、MPOTab.2 Blank group，control group，experimental group 1 and experimental group 2 IL-6，IL-1β，SOD，MDA，MPO ±s

注：与空白组比较，*P ＜0.05；与对照组比较，#P ＜0.05；与实验组1 比较，&P ＜0.05

组别空白组对照组实验组1实验组2 IL-6（pg/mL）15.3±5.5 74.6±16.5*66.8±14.2*60.6±13.6*#&IL-1β（pg/mL）25.2±18.2 149.5±44.6*145.5±46.3*130.3±48.5*#&SOD（u/g）52.6±15.3 206.5±36.4*224.4±32.8*237.7±33.6*#&MDA（nmol/mg）38.6±11.3 186.5±20.6*181.2±22.8*175.2±24.6*#&MPO（ng/mL）69.2±12.5 279.2±48.6*272.5±40.6*248.5±32.6*#&

2.4 空白组、对照组、实验组1 及实验组2 的HMGB1 蛋白免疫印迹 对照组HMGB1 分别与空白组、实验组1 及实验组2 比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 空白组、对照组、实验组1 及实验组2 的HMGB1 蛋白免疫印迹Fig.2 Western blot of HMGB1 protein in blank group，control group，experimental group 1 and experimental group 2

2.5 空白组、对照组及实验组（1、2）的肺组织病理切片 实验组1 较实验组2 肺泡内皮及肺泡组织明显破坏，炎性细胞浸润明显。对照组较实验组1及实验组2 肺泡内皮及肺泡组织破坏严重，炎性细胞浸润更加明显。见图3。

图3 空白组、对照组及实验组1 及实验组2 肺组织病理切片（HE 染色×200）Fig.3 Pathological sections of lung tissues in blank group，control group，experimental group 1 and experimental group 2（HE×200）

3 讨论

严重失血是创伤导致死亡的主要原因，约占创伤致死的30% ～40%［8］。在失血性休克发生后肺往往是最先和最易受累的器官，一般发病早期即可出现ALI，ALI 的发生率高达80%以上［9］。创伤失血性休克的处理主要在于早期的液体复苏，恢复机体有效血容量，满足组织的灌注阻止器官组织缺血坏死［10］。然而，在液体复苏时，往往引起组织再灌注损伤。组织产生大量的氧自由基，氧自由基可作为信息分子，广泛激活炎症系统，在肺组织中会有大量炎性细胞的聚集，并产生大量的细胞因子、趋化因子、氧自由基及其他一些炎性介质等，可引起肺部炎症和ALI［11-14］。

HMGB1 是一种保守的非组蛋白核蛋白，广泛分布于淋巴、脑、肝、肺、心、肾等组织中，胞核HMGB1 可调控核小体稳定、DNA 的重组复制、修复及转录。研究［15］表明，HMGB1 参与了失血性休克急性肺损伤的过程，失血性休克可引起组织中HMGB1 浓度升高，HMGB1 可诱导NF-κB、IL-1β等炎症因子释放进而诱发ALI，抑制HMGB1 信号可减轻ALI。

氢气可选择性的作用于活性氧簇ONOO-和OH-，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡作用，能减轻组织缺血再灌注损伤。研究［16］证明，在鼠脓毒症模型中，吸入氢气，可抑制氧化应激，降低血液、肝、肾、肺组织中HMGB1 的浓度。在肝缺血再灌注损伤大鼠模型中，氢气同样可减轻氧化应激反应，抑制HMGB1 的释放，抑制炎症反应，从而发挥肝保护作用［17-19］。

乳果糖是一种人工合成的双糖，常被用于便秘和肝性脑病等的治疗。乳果糖可被定植在胃肠道的菌群分解，产生大量的氢气，发挥组织保护作用［20］。在大鼠大脑中动脉栓塞模型中，乳果糖通过胃肠道的菌群分解产生氢气，氢气进入脑组织减轻氧化性损伤、细胞凋亡，减少梗死面积［21］。在70%部分肝切除肝再生大鼠模型中，乳果糖通过胃肠道的菌群分解产生氢气，氢气进入肝组织可升高SOD 水平，抑制HMGB1，进而降低ALT、AST及丙二醛MDA 的水平，促进肝细胞再生［22］。

IL-6、IL-1β 具有较强的促炎活性，可诱导多种促炎介质，如细胞因子和趋化因子，并最终导致广泛的炎症事件。SOD 是生物体内存在的一种抗氧化金属酶，它能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，降低MDA、MPO 及多种炎性介质的水平，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用，与很多疾病的发生、发展密不可分［23］。本研究结果显示空白组IL-6、IL-1β、SOD、MDA、MPO 分别与对照组、实验组1 及实验组2 比较均有明显差异，且对照组、实验组1 及实验组2 上述指标均大幅度增高；实验组2 除SOD 结果高于对照组及实验组1 外，IL-6、IL-1β、MDA、MPO 较对照组及实验组1 低；然而实验组1 较对照组上述指标无明显差异，可能与最后实验采集标本时间过短有关，未能达到预期值。在肺病理学切片结果可以看出实验组1较实验组2肺泡内皮及肺泡组织明显破坏，炎性细胞浸润明显。对照组较实验组1及实验组2 肺泡内皮及肺泡组织破坏及炎性细胞浸润更加明显。血气分析结果可以看出在225 min 时，对照组Po2明显低于空白组、实验组1 及实验组2，提示失血性休克模型引发了模型急性肺损伤，而乳果糖减轻了模型的急性肺损伤，增加了氧饱和度。以上结果说明乳果糖预灌胃组对肺组织保护作用要优于失血性休克造模后乳果糖灌胃组，进一步说明乳果糖对失血性休克大鼠的肺组织具有保护作用。

HMGB1 可调控核小体稳定、DNA 的重组复制、修复及转录，诱导多种炎性因子的释放，如IL-6、IL-1β 等，进而造成多种器官的损伤［24］。本研究结果显示实验组1 较实验组2 HMGB1 蛋白水平高。对照组较空白组、实验组1 及实验组2 HMGB1蛋白含量最高。从上述结果可以看出失血性休克时可引起体内HMGB1 蛋白含量迅速增高，而实验组1 及实验组2 HMGB1 蛋白含量明显低于对照组，提示乳果糖可降低失血性休克大鼠模型的HMGB1 蛋白含量，进而降低IL-6、IL-1β 等炎性因子，保护肺组织。

综上所述，在失血性休克模型中，乳果糖可通过胃肠道的菌群分解产生氢气，氢气快速进入组织可促进SOD 的生成并抑制HMGB1 的生成，进而抑制IL-6、IL-1β、MDA、MPO 等炎性介质的释放，保护肺组织，这将为临床抢救失血性休克患者、预防ALI 提供参考及干预的靶点。