长链脂酰辅酶A合成酶4调控环氧合酶2促进乳腺癌细胞转移的作用机制研究

林佳敏 杨娜 张苹苹 徐邦牢

华南理工大学附属第二医院检验科（广州510180）

2020年我国新增乳腺癌确诊病例占全球24%，癌症相关死亡病例占全球30%，女性癌症患者乳腺癌的发病率已居首位［1］。研究表明，乳腺癌复发和转移相关的并发症是乳腺癌患者死亡的主要原因［2］。脂质代谢异常是癌细胞的重要标志之一，脂质代谢重编程为肿瘤转移提供了新的选择性优势［3-4］。游离脂肪酸在代谢之前必须经过酰基辅酶A 合成酶激活成酰基辅酶A 酯，长链脂酰辅酶A合成酶（ACSLs）家族的失调会改变细胞内游离脂肪酸的分布、种类和数量［5］，从而导致癌症和其他代谢疾病，目前乳腺癌细胞转移过程中关键代谢酶的调控机制仍有待阐明。

长链脂酰辅酶A 合成酶4（ACSL4）是催化长链脂酸代谢的重要限速酶，属于ACSLs 家族中的一员。ACSL4 对长链多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）如花生四烯酸（arachidonic acid，AA）的亲和力较高［6］，AA 的代谢产物尤其是前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）与多种生物过程有关［7］。环氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX2）是AA 催化产生PGE2 重要的限速酶［8］。ACSL4 在侵袭性三阴乳腺癌表达更高，抑制ACSL4 可以减少细胞侵袭转移［9］。虽然有研究显示ACSL4 和COX2 对肿瘤增殖的影响［10］，但其是否促进肿瘤的侵袭转移，仍有待进一步阐明。本研究旨在探讨ACSL4 是否通过调控COX2 促进乳腺癌转移，研究代谢关键酶ACSL4 调控脂酸代谢促进乳腺癌转移的作用，对开发乳腺癌转移的治疗新策略具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料 人乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7 细胞株由本实验室保存；DMEM 高糖培养基（Gibco公司，美国）、胎牛血清（BI 公司，英国）；新霉素和嘌呤霉素（索莱宝，中国）、0.25%胰蛋白酶（索莱宝，中国）；Trizol（Invertrogen，美国）；Transwell 小室（Corning 公司，美国）；ACSL4 兔来源一抗（Abcam 公司，美国），COX2 兔来源一抗（CST，美国）；VIMENTIN 兔来源一抗（CST，美国）；GAPDH 鼠来源一抗（Proteintech，中国）；PGE2 Elisa 检测试剂盒（Elabscience，中国）；定量PCR 试剂（赛默飞，美国）；逆转录酶（Takara，日本）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 MDA-MB-231 和MCF-7 乳腺癌细胞，用含10%胎牛血清、1%双抗DMEM 高糖培养基，在37 ℃、含5%CO2的培养箱中培养细胞。

1.2.2 小干扰RAN（siRNA）转染和稳定细胞系建立 转染siRNA 由上海吉玛生物公司合成，siACSL4：sense5′-GAGGCUUCCUAUCUGAUUATT-3′，antisense5′ - UAAUCAGAUAGGAAGCCUCTT - 3′ ；MDA-MB-231 细胞转染按lipo-2000 的说明书进行。过表达ACSL4 慢病毒购于汉恒生物公司，按照公司说明书感染MCF-7 乳腺癌细胞，用1 mg/mL嘌呤霉素筛选。转染48 h，提取RNA 和蛋白质，分析基因水平和蛋白水平的变化。

1.2.3 RT-PCR 检测mRNA 表达 Trizol 法提取细胞的总RNA，调节RNA 浓度为1 000 ng/μL，按照Takara RNA 逆转试剂盒说明书进行逆转录，获得cDNA。采用SYBR Green PCR master mix 试剂盒进行qRT-PCR。根据2-ΔΔct值计算相对表达量。

1.2.4 Western blot 提取细胞总蛋白，加入5×loading buffer 后100 ℃水浴使蛋白变性，配置10%的SDS-PAGE分离胶和5%浓缩胶，分离蛋白（60 V，30 min 后换100 V，1 h），转膜（冰浴，100 V，1 h），封闭（5%脱脂奶粉，室温，1.5 h），使用一抗稀释液稀释ACSL4（1∶10 000）、COX2（1∶1 000）、VIMENTIN（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000）一抗，4 ℃过夜。二抗（1∶1 000）常温1.5 h，TBST洗膜后ECL显影。

1.2.5 ELISA PGE2 检测参照Elabscience 公司ELISA 试剂盒说明进行。

1.2.6 迁移实验 细胞生长到80%融合度时，用0.25%的胰酶消化，细胞消化后用无血清DMEM高糖培养基重悬细胞，调整细胞浓度为5 × 104个/mL。吸取200 μL 细胞悬液加入Transwell 小室上室，下室加入含10%血清的DMEM 完全培养基700 μL。24 h 后取出小室，去除培养基，4%多聚甲醛固定10 min 后，擦去小室上层的细胞，下层细胞用结晶紫染色30 min，在显微镜下拍照。

1.2.7 划痕实验 细胞生长到90%融合度时，用0.25%的胰酶消化，用完全培养基重悬细胞，铺板12 孔板，每个重复3 次，当24 h 细胞达到80% ～90%融合度时，使用10 μL 的枪头划痕，分别在0 h和24 h，显微镜下记录细胞迁移的面积。

1.3 统计学方法 用GraphPad 8.0 软件进行统计学分析，计量结果以（）表示，计量资料两组对比采用独立样本t检验，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ACSL4 对乳腺癌转移的影响 通过划痕实验和Transwell 实验发现，利用siRNA 瞬时敲低高侵袭性的MDA-MB-231 乳腺癌细胞ACSL4 表达后，其转移能力被显著抑制（P＜0.05，图1A-B）。在低侵袭性的MCF-7 细胞中过表达ACSL4 后，其转移能力显著增强（P＜0.05，图1C-D）。由此可见，内源性敲低或升高ACSL4 可以相应的降低或升高细胞的侵袭能力。

图1 ACSL4 对乳腺癌转移的影响Fig.1 Effect of ACSL4 on breast cancer metastasis

2.2 生物信息学分析 GEPIA 在线分析TCGA 数据库里，ACSL4 与COX2 表达呈正相关（r= 0.15，P＜0.05，图2）。

图2 TCGA 乳腺癌组织ACSL4 与COX2 基因表达相关性Fig.2 Correlation between ACSL4 and COX2 gene expression in TCGA breast cancer tissues

2.3 ACSL4 对乳腺癌细胞COX2 表达的影响 敲低高侵袭性的MDA-MB-231 乳腺癌细胞的ACSL4后，环氧合酶2（COX2）和波形蛋白（Vimentin）的基因表达水平和蛋白水平降低。过表达低侵袭性的MCF-7 细胞ACSL4 后，COX2 和波形蛋白表达水平升高（图3）。

图3 ACSL4 对乳腺癌细胞COX2 表达的影响Fig.3 Effect of ACSL4 on COX2 expression in breast cancer cells

2.4 ACSL4 对乳腺癌细胞PGE2 分泌水平的影响 敲低高侵袭性的MDA-MB-231 细胞的ACSL4后，通过ELISA 检测细胞分泌的PGE2 的含量，PGE2的分泌量下降了29.8%（图4A），在低侵袭性的MCF-7 乳腺癌细胞里过表达ACSL4，细胞分泌的PGE2 的含量升高29.5%，P＜0.05（图4B）。

图4 ACSL4 对乳腺癌细胞PGE2 分泌水平的影响Fig.4 Effect of ACSL4 on PGE2 secretion level of breast cancer cells

3 讨论

ACSLs 家族是长链脂肪酸活化必需的酶（12 ～20 个碳原子），在哺乳动物中ACSLs 有五种亚型，即ACSL1、ACSL3、ACSL4、ACSL5 和ACSL6，它们在长链脂肪酸的激活中具有相似又特定的作用［11］。ACSL4 的偏好底物为二十碳多不饱和脂肪酸（PUFA），如花生四烯酸（AA）和二十碳五烯酸（EPA）［12］，ACSL4 表达会增加游离AA 向PGE2 转化［13］。ACSL4 表达与乳腺癌细胞中的侵袭性表型相关，在侵袭性三阴乳腺癌中表达更多。17 β-雌二醇增加ACSL4 表达并促进AA 和EPA 的吸收。ASCL4 沉默阻止了17β-雌二醇诱导的p-Akt 和p-GSK3β 的上调和E-cadherin 的减少，从而减弱了癌细胞的侵袭能力［14］。虽然有研究表明，在乳腺癌侵袭性表型中，抑制ACSL4-LOX-COX2 通路可以显著降低肿瘤生长，但ACSL4 促进乳腺癌转移的具体机制还有待阐明［10］。本研究显示ACSL4能明显增强乳腺癌细胞系的迁移和侵袭能力。内源性ACSL4 的缺失或升高，可以分别抑制或提高MDA-MB-231 和MCF-7 细胞的侵袭能力，提示ACSL4 是乳腺癌细胞侵袭促进因子，为乳腺癌的治疗提供了新的治疗靶标。

AA 通过三种不同酶催化的途径产生不同的生物活性产物：环氧合酶（COX）、脂肪氧化酶（LOX）和细胞色素P450（CYP）通路［15］。COX 家族成员，包括COX1 和COX2，介导AA 转化为PGH2，PGH2 随后代谢为PGD2、PGE2、PGF2α、PGI2，和血栓素A2（TXA2）［16］。源自COX2 的PGE2 可以激活结肠癌中雷帕霉素复合物1（mechanistic target of rapamycin complex 1，mTORC1）信号转导的机制靶点，从而促进VEGF 的表达和释放，引起细胞增殖能力增强和血管生成［17］。另一项研究表明，PGE2激活EP1R，从而通过涉及蛋白激酶C（PKC）、NF-κB和叉头盒蛋白C2（FoxC2）的信号传导增加β1-整联蛋白的表达，诱导癌细胞转移［18］。本研究通过生物信息学分析了ACSL4 与COX2 存在正相关关系，在MDA-MB-231 细胞中敲低ACSL4，可以在mRNA 水平和蛋白水平上降低COX2 的表达，同时，通过ELISA 检测细胞分泌的PGE2 的水平减低，在MCF-7 细胞中过表达ACSL4，可以在蛋白水平上提高COX2，通过ELISA 检测细胞分泌的PGE2的水平升高，与生物信息学预测结果一致，进一步提示ACSL4 通过调控COX2 的表达，催化AA 生成PGE2，增加PGE2 的生成。

波形蛋白是间充质细胞中的一种Ⅲ型中间丝蛋白，主要在成纤维细胞、内皮细胞和淋巴细胞中表达［19］，在细胞水平上，波形蛋白参与细胞迁移、分化、增殖、粘附和侵袭［20］。有研究表明，波形蛋白高表达与乳腺癌淋巴结转移有一定的相关性，是影响乳腺癌预后的潜在因素［21］。本研究结果显示在MDA-MB-231 细胞中敲低ACSL4，可以在mRNA 和蛋白水平降低波形蛋白的表达，在MCF-7细胞中过表达ACSL4，可以在蛋白水平上升高波形蛋白的表达。进一步提示了ACSL4 与乳腺癌转移密切相关，ACSL4 可能是通过调节COX2 促进PGE2 的分泌，增强了乳腺癌细胞的侵袭转移的能力，这可能是乳腺癌侵袭转移的机制之一。

综上所述，本研究目前在细胞水平揭示了ACSL4 可以促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力，其主要通过调节COX2 促进PGE2 分泌发挥作用。下一步需要在动物体内实验验证ACSL4-COX2 在乳腺癌转移过程中的作用，深入研究ACSL4 调节COX2 的分子机制以及代谢产物PGE2 涉及的信号通路对乳腺癌发生发展的影响，以期开发针对乳腺癌转移的治疗新策略。