ATF4、CHOP在原发性干燥综合征患者唇腺中的表达及其与阴虚证和湿热证的相关性＊

金 洁，薛 鸾，侯佳奇＊＊

（1.上海中医药大学岳阳临床医学院 上海 201203；2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院 上海 200437）

原发性干燥综合征（Primary Sjögren syndrome，pSS）是一种慢性自身免疫性疾病，自身抗体的产生以及淋巴细胞浸润外分泌腺（唾液腺和泪腺为主）是其主要特征，从而导致分泌功能的障碍[1]，约95%患者可出现口干、眼干的表现[2]，也有腺体外器官异常所导致的多系统损害，比如肾脏、血管、肌肉、神经等受累，大约5%的患者可发生淋巴细胞性恶性肿瘤[3]。该病在我国的发病率为0.29%-0.77%，是发病率最高的自身免疫病之一，发病年龄在50 岁左右，多见于围绝经期或绝经后妇女[4]。目前pSS的发病机制尚未明确，多数认为是由环境、基因等多种因素导致的免疫失调和耐受性丧失[5]，与T、B细胞的功能异常有关。

pSS 上皮细胞作为抗原呈递细胞，通过细胞因子的产生和大量免疫细胞的募集，在炎症环境的形成中起着核心作用，积极促进炎症环境的形成[6-7]，因此上皮细胞被认为是pSS发病机制的主要组成部分。唾液腺上皮细胞（salivary gland epithelial cells, SGEC）作为分泌细胞，是内质网延伸最广的细胞之一，它们不断分泌大量的唾液，唾液中含有丰富的蛋白质，其产生和分泌依赖于细胞内质网的生理功能和钙稳态[8]，当SGEC 受到长时间的刺激如损伤或长期处于炎症中，那么内质网的生理功能和钙稳态就会受到破坏[9]，这时内质网会产生一个压力，便可以引起内质网应激。在稳定状态时，正常的细胞中，大约三分一在内质网中生成的蛋白质会产生错误的蛋白质折叠[10]，当细胞处于压力时，蛋白质的错误折叠率和未折叠率增高，细胞为恢复正常生理功能，保持内质网的稳态，则会出现一系列的应对反应，其中包括未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR），UPR 可以激活三条信号通路：IRE1α-XBP1 通路、ATF6-ATF6f 通路、PERK-ATF4 通路。其中，蛋白激酶R 样内质网激酶（ProteinkinaseRNA-like ERkinase, PERK）是一种I 型内质网跨膜蛋白激酶，无内质网应激时，PERK 与内质网伴侣蛋白GRP78/Bip 结合，当内质网应激发生时，PERK 与GRP78/Bip 解离，此时PERK-ATF4 信号通路被激活，活化的PERK 可以使真核起始因子2（eukaryotic initiation factor 2,eIF2α）发生磷酸化，与此同时，p-PERK 和p-eIF2α 激活ATF4，上调ATF4 的表达，ATF4的增加诱导凋亡蛋白CHOP 的产生。UPR 最初是为了恢复蛋白质的稳态和生理功能，当压力持续时间过长或者细胞损伤过于严重，便会导致CHOP 的持续表达，动态平衡不能恢复，则最终可以引起细胞凋亡[11-12]。

目前，pSS 的治疗多以改善症状，延缓脏器损害为主要目的，但仍无循证医学依据的有效药物，中医药在改善pSS 的临床症状上发挥了充分的优势，课题组前期的研究发现中药可以调节pSS 患者的自身免疫，改善炎症[13-14]，改善模型动物的干燥症状，降低免疫球蛋白IgA、IgG 的水平等[15-16]。国医大师路志正首次提出将“燥痹”作为pSS 的中医名称，其中阴虚型和湿热型为临床常见证型，课题组前期研究发现湿热组的pSS 患者泌尿系统、神经系统、消化系统等受累的发生率高于阴虚组[17]，可见不同的中医证型发病方式可能存在一定的差异。pSS 患者唾液腺上皮细胞存在内质网应激，那么其在不同中医证型中是否有差异也值得我们探讨，联合中西医共同分析pSS发病机制，不仅可以为pSS 的治疗挖掘更多的靶点，也为中医药的治疗提供一定的理论依据，达到更好的中西医结合的效果。因此本实验通过观察pSS 患者唇腺组织中ATF4、CHOP 的表达，并分析其相关性，为临床的中西医治疗提供基础。

1 资料和方法

1.1 一般资料

根据2010年国家中医药管理局医政司制定的《22个专业95个病种中医诊疗方案》燥痹（干燥综合征）诊断标准筛选出在上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院风湿科就诊的，时间段为2018年5月至2021年1 月，阴虚型和湿热型pSS 患者各20例，收集其唇腺组织40 例，每位pSS 患者的诊断均符合pSS 的诊断标准[18]，其中女性39 例，男性2 例，年龄32-85（57.2±11.50）岁。并筛选出同时间段的口干燥症患者唇腺组织20例，其中女性19例，男性1例，口干燥症患者均为曾经怀疑pSS 诊断最后又排除的，年龄36-75（58.6±10.27）岁。每位患者在行唇腺活检之前均未接受治疗。

1.2 免疫组织化学检测及结果判定

将唇腺组织的石蜡包块切成3 μm 厚度的石蜡切片，经过烤片，脱蜡，抗原热修复，3%过氧化氢溶液去除内源性酶，水洗，封闭，DAB 染色，苏木精复染、脱水等步骤。设阳性、阴性和空白对照，PBS代替一抗作为空白对照，兔抗人单克隆抗体ATF4 购自Abcam 公司，兔抗人单克隆抗体CHOP购自Affinity Biosciences LTD公司。

每个切片随机观察5 个高倍视野（×200）。阳性细胞：＜10%，10%-25%，25%-50%，＞50%分别记为0、1、2、3 分。染色强度：阴性(-)，弱阳性(+)，中阳性(++)，强阳性(+++)分别记为0、1、2、3 分。两者的乘积0、1-2、3-4、6-9 分别算作阴性（-），弱阳性(+)，中阳性(++)，强阳性(+++)。

1.3 SS疾病活动度评分

根据欧洲抗风湿病联盟干燥综合征疾病活动度评 分（EULAR Sjögren’s Syndrome Disease Activity Index，ESSDAI）对患者进行疾病活动度的评分[19]。

1.4 唾液流率及血清学指标

包括唾液流率，细胞因子IL-1β、IL-2R、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α，抗核抗体滴度，补体C3、C4，免疫球蛋白IgG、IgA、IgM，类风湿因子（rheumatoid factor，RF）,白细胞（white blood cel，WBC）,血小板（platelet，PLT）,血红蛋白（Hemoglobin，Hb）。其中抗核抗体滴度＜1:100 记0 分，1:100 记1 分，1:160 记2 分，≥1:320记3分。

1.5 统计方法

使用spss21.0 统计软件进行数据处理，P＜0.05 即差异有统计学意义。计量资料符合正态分布以均数±标准差（±s）表示，等级资料使用Mann-Whitney U 检验，相关性分析使用spearman等级相关分析。

2 结果

2.1 ATF4、CHOP在唇腺组织中的表达

在唇腺组织切片中，唾液腺上皮细胞的细胞核中可见ATF4阳性染色（图1），唾液腺上皮细胞的细胞质中CHOP 阳性染色（图2）。ATF4、CHOP 在pSS 患者唇腺中的表达增多，与非pSS 患者唇腺中的表达相比具有显著的统计学差异（均P＜0.001）（表1）。

图1 ATF4在唇腺组织中的表达（IHC,×200）

图2 CHOP在唇腺组织中的表达

表1 ATF4、CHOP在pSS、非pSS患者唇腺中的表达差异

2.2 ATF4 与CHOP、疾病活动度、实验室指标相关性

经Spearman 统计分析，ATF4 在唇腺中的表达与CHOP 的表达、病程、ESSDAI 评分、IL-6、TNF-α、IgA呈 正 相 关（r=0.599，P＜0.001；r=0.400，P=0.002；r=0.656，P＜0.001；r=0.491，P＜0.001；r=0.514，P＜0.001；r=0.293，P=0.023），与唾液流率、C4 呈负相关（r=-0.457，P＜0.001；r=-0.264，P=0.042）（表2）。

表2 ATF4与CHOP和其他指标的相关性

2.3 CHOP与疾病活动度、实验室指标相关性

经Spearman 统计分析，CHOP 在唇腺中的表达与病程、ESSDAI 评分、IL-6、TNF-α、IgA 呈正相关（r=0.273，P=0.035；r=0.310，P=0.016；r=0.75，P＜0.001；r=0.649，P＜0.001；r=0.671，P＜0.001），与唾液流率呈负相关（r=-0.739，P＜0.001）（表3）。

表3 CHOP和其他指标的相关性

2.4 ATF4和CHOP与中医证型间的差异

经Mann-Whitney U 统计分析显示，ATF4 在湿热型的pSS 患者唇腺中的表达高于阴虚型，两者有显著统计学上的差异（P=0.009），CHOP 在湿热型与阴虚型pSS 患者唇腺中的表达无明显统计学的差异（P＞0.05）（表4）。

表4 ATF4、CHOP与中医证型之间的相关性

3 讨论

pSS作为一种自身免疫性疾病，其发病的关键是B淋巴细胞增殖和T 淋巴细胞亚群的活化，并分泌大量的免疫球蛋白，激活的自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）以及辅助性T细胞1（helper T cell 1，TH1）、辅助性T 细胞17（helper T cell 17，TH17）会产生一些促炎细胞因子如IL-1、IL-6、IFN-γ 和TNF-α 等，造成炎症环境[20]。B 细胞在滤泡辅助性T 细胞（Follicular helper T cell, Tfh）促进下向浆细胞分化，浆细胞活化后，产生各种自身抗体，出现免疫复合物，尤其是与Ro（或SS-A）和La（或SS-B）自身抗原结合。除上述外，pSS 还有可检测到的RF 以及抗核自身抗体（ANAs）的产生等额外特征[21]。最终导致唾液腺、泪腺等外分泌腺甚至腺体外器官的损害。临床上常用唾液流率判断唾液腺细胞的损伤程度，并且以未刺激的唾液流率≤0.1ml/min 作为诊断标准之一。常使用SSDAI、SCAI、ESSDAI 判断pSS 患者疾病活动度,还有一种方法可以判断患者主观症状即ESSPRI,ESSPRI 经常与ESSDAI配合应用，是现在临床使用最多的对疾病活动程度进行评判的体系。

近年来内质网应激在代谢性疾病、自身免疫病等多种疾病中发挥调控作用，逐渐受到关注并进行了大量研究。有证据表明pSS患者唾液腺的分泌途径改变并存在内质网的扩张和应激[22-23]，内质网应激也可能是pSS的发病机制之一。内质网是负责细胞功能的细胞器，包括蛋白质折叠和成熟以及维持细胞的内环境[24]。当蛋白质加工出现问题，则会导致错误折叠的蛋白质在内质网中积聚，产生缺氧、蛋白质超载、钙代谢紊乱、细胞内ATP 水平降低和氧化应激等反应。当蛋白质聚集超过负荷时，则会导致内质网异常。

内质网应激反应是炎症和细胞凋亡的关键介质，UPR 作为机体维持正常内环境稳定反应的适应机制，由三个信号轴组成，由共同的内质网驻留传感器分子Bip 调节，当内质网不能适应其压力时，便会促进炎症、凋亡、自噬的发生，其中凋亡主要通过激活PERKeIF2α-ATF4-CHOP 通路。越来越多的研究证明PERK 的活化在慢性的内质网应激的过程中持续存在，是内质网应激最直接的早期反应，并且着伴随ATF6α 和IRE1α 的活化。内质网应激与免疫反应关联的重点是UPR 和炎症信号的交互作用，实质细胞内的内质网稳态的紊乱可以触发和增强炎症反应，UPR三种信号通路均可激活NF-κB，参与促炎细胞因子的表达，加速应激诱导的细胞凋亡。反之，也有研究表明炎症信号如TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ的产生可以触发慢性内质网应激，两者相互影响[22,25]，其中IL-6 似乎被认为是与内质网应激相关的关键细胞因子之一，UPR 的多个分支已被报道在不同的细胞中刺激IL-6的表达[26]。UPR 信号可促进T 细胞发育以及在抗原触发的B 细胞分化为产生免疫球蛋白的浆细胞中起作用。UPR 相关分子表达的改变可以帮助自身免疫病的启动，在类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、系统性硬化症等自身免疫病中均发现了抗内质网伴侣抗体，提示自身免疫病中的内质网过度应激[27]。

Barrera M-J 的研究发现，pSS 患者唇腺组织中的p-PERK/PERK 比值、ATF4的表达均升高，表明内质网应激UPR 信号的PERK-ATF4通路在唾液腺组织中存在并且起作用[28]。ATF4 是PERK 信号通路上的重要靶点，PERK 信号途径通过磷酸化激活eIf2α 将ATF4转运到细胞核中，增加ATF4 表达水平，参与抗氧化反应、调控自噬、诱导凋亡等。UPR 可以通过ATF4 与IL-6 启动子结合并诱导细胞因子来促进炎症反应，并刺激炎症小体关键成分NLRP1的表达。除此ATF4通过在应激条件下的代谢重编程在T细胞介导的免疫反应中产生重要作用[29]。在PERK-ATF4 通路中，ATF4的选择性翻译直接上调了CHOP 的表达，两者协同诱导参与氨基酸生物合成、氨基酸运输、细胞内自噬和细胞凋亡的多个基因[30]。细胞凋亡是由促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白共同调节，包括Bcl2 家族成员和Caspase家族成员。ATF4 可以促进X 连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）的 降 解，XIAP 是 一 种 能 使caspase-9 和caspase-3 失活的凋亡抑制蛋白，因此ATF4 有助于caspase 的激活，引发唾液腺细胞的凋亡。CHOP 可通过caspase-12 直接激活效应酶caspase-3 和caspase-9促进细胞凋亡，并且可以激活NLRP3 炎症体（Caspase-11、Caspase-1、IL-1β）的活性[31-32]。除此，CHOP 可诱导促凋亡基因DR5、TRB3、BIM 和PUMA 的表达，并抑制BCL2 的表达，从而在内质网应激过程中触发细胞凋亡[33-34]，造成唾液腺细胞的损伤。

本研究中，pSS患者唇腺组织中ATF4、CHOP 的高表达及相关性分析提示pSS 患者唾液腺组织中存在PERK-ATF4 通路的激活，并且与免疫、炎症、ESSDAI评分等疾病活动指标以及唾液腺损伤有一定的相关性，证明UPR信号在pSS发病中产生一定的作用。

在中医上，pSS 往往是阴虚津亏，生化不足而成燥，燥邪蕴结不能缓解，津液的产生及输布发生障碍，则不能濡养肌肤、孔窍等。另外，脾虚失运导致湿热内生，水液不能正常输布，同样也可导致干燥的产生。因此临床常见阴虚和湿热两种证型。湿热有粘滞、耗伤津液的特点，在相关中医证型的研究中，湿热型pSS患者的细胞因子水平如IL-6、TNF-α、CRP、ESR 等高于阴虚型[35-36]，以及课题组前期研究发现的湿热组pSS患者泌尿系统、神经系统、消化系统等受累的发生率高于阴虚组，也可能与湿热证炎症程度更高有关。可见湿热证与炎症的关系较为密切。湿热证往往是内在致炎病因的存在与炎症网络的持续活化[37]，可从不同程度上导致炎症的发生、发展。ATF4 在湿热型的pSS 患者唇腺中的高表达，从中医角度表现了炎症信号是内质网应激与免疫反应的关键，并且提示不同的中医证型可能具有不一样的发病机制及发病方式。内质网应激在不同中医证型中的表达值得我们做进一步的研究，不仅为中医治疗pSS 提供一定的理论基础，更有利中西医治疗的结合。

UPR 拥有双面作用，适当的UPR 在细胞的发育、分化、功能和存活中具有重要作用，可维护细胞稳态，产生积极作用，过度的UPR 对会细胞造成不可逆的损伤，但是在自身免疫性疾病的发生过程中激活UPR 信号以及维持UPR发展的机制还不完全清楚，对UPR的研究利于了解生物体如何面对压力，并且可能为pSS的治疗提供新的靶点。