扩心方通过调节TGF-β1/Smad2通路改善扩张型心肌病大鼠心肌纤维化＊

吴 琼，董艺丹，王佑华，彭珑萍，王延文，魏易洪，王 怿，周 嫦，马梦娇，周茂琳，周 端

（上海中医药大学附属龙华医院 上海 200032）

扩张型心肌病（Dilated Cardiomyopathy，DCM）猝死率高、预后差，属原发性混合型心肌病的一种，其发病原因不明，病理机制复杂，常因心室重塑引起心脏扩大及心肌收缩功能进行性降低，从而引起难治性心力衰竭，恶性心律失常，血栓栓塞、心源性休克甚至猝死等[1]。心肌纤维化的发生不仅是DCM心肌重塑的重要病理过程，同时也是诸多心血管疾病发病的共同病理改变。这种改变通常包括细胞外基质过量沉积、纤维蛋白增生、各型胶原比例失调，从而导致心脏僵硬度增加，心脏舒张功能减退，当剩余心肌细胞收缩功能代偿不足时导致收缩功能下降[2-3]。TGF-β1/Smads信号通路广泛参与心肌纤维化，而TGF-β1 作为一种重要的促心肌纤维化细胞因子，在病理性心肌纤维化中其表达量明显增加，随后刺激心脏成纤维细胞增生、胶原合成，激活TGF-β1/Smads 通路从而导致心肌重塑[4-5]。因此调节TGF-β1/Smads 信号通路对延缓DCM心肌纤维化有重要意义。

结合长期临床实践对于扩张型心肌病发病演变规律的认识，上海中医药大学附属龙华医院终身教授周端认为扩张型心肌病基本病机为“正虚（气阴虚损）邪阻（瘀痰水阻留）”，治以益气养阴、活血化痰利水，并设扩心方治疗。以扩心方为主方的中药方剂已经作为我院院内用于防治扩张型心肌病的协定方，广泛运用于临床患者，且收到良好效果[6]，但对于其治疗的作用机制还有待探讨。心肌纤维化是引起DCM 诸多临床并发症的根本原因，从中医临床有效方药中寻找防治扩张型心肌病心肌纤维化的药物是学者们关注的问题。故本研究将以缓解心肌纤维化为切入点，探究扩心方治疗扩张型心肌病的可能的作用机制，以期为临床运用扩心方提供充实的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

雄性、SPF 级Wistar 大鼠共68 只，体质量170-220 g，购自上海中医药大学实验动物中心，动物合格证号：SYXK（沪）2014-0008。

1.1.2 药品

扩心方：生黄芪30 g，黄精30 g，灵芝9 g，丹参15 g，水蛭6 g，瓜蒌皮30 g，桂枝3 g，黄荆子9 g，毛冬青30 g，猫人参30 g。参照课题组前期工作，由上海中医药大学附属龙华医院中药制剂室按照操作流程以水煎煮、真空浓缩、喷雾干燥、干式制粒备用[7]。西药：卡托普利（阳性对照药，中美上海施贵宝制药有限公司生产，国药准字：H31022986)。阿霉素（Dox）（造模用药，10mg/瓶，4℃保存，深圳万乐药业有限公司生产）。

1.1.3 主要试剂与仪器

戊巴比妥钠，4%多聚甲醛溶液购自国药集团、Collagen I 抗体（ARG21965，Arigo）、Collagen III 抗体（ARG20786，Arigo）、TGF-β 抗体（ARG10002，arigo）、Smad2 抗体（ab40855，Abcam）羊抗兔II 抗（CST 公司，货号7074S）、Fresco 17 低温高速台式离心机（美国）、4RM2016 病理切片机（德国）、PE Victor 酶标仪（美国）、Olympus光学显微镜（日本）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型制备与分组

SPF 级Wistar 大鼠共68 只，适应性饲养1 周。本实验设空白对照组，即正常组（Con 组）8 只，考虑造模死亡率以及需要取心脏用于多个指标检测，余60只设为模型组。按照文献[8]和课题组前期研究方法复制DCM 模型[7]，用0.9%氯化钠溶液将Dox 溶解配成浓度为1mg/mL 的溶液，腹腔注射Dox2.5mg/kg，正常组8 只大鼠腹腔注射相同剂量的氯化钠溶液，每周1 次，共6次，阿霉素的总共剂量达到15mg/kg，2 周后从正常组随机挑选3 只、模型组随机挑选10 只进行心脏超声，检测左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室舒张期末径（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、左室收缩期末径（left ventricular end systolic diameter，LVESD）、左 室 短 轴 缩 短 率（fraction shortening，LVFS），造模组与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.05），即造模成功。造模成功后60只大鼠随机分为模型组（Dox 组），扩心方低（KXF-L）、扩心方中（KXF-M 组）、扩心方高（KXF-H 组）剂量组、卡扩普利组（Cap组）每组12只，设6只为1笼。

1.2.2 给药

结合文献及前期工作，造模成功后即开始给实验大鼠灌胃进行干预。根据体表面积换算法得出大鼠灌胃剂量：①扩心方低剂量为3.6 g/(kg·天)，扩心方中剂量为3.6 g/(kg·天)，扩心方高剂量为7.2 g/(kg·天)；②卡托普利组给药量为5mg/(kg·天)；③正常组和模型组给予与KXF-M 组等剂量的0.9%氯化钠溶液，每天灌胃给药1次，共干预4周。

1.2.3 心超检测

于药物干预后第4周末，用浓度为3%戊巴比妥钠1.17 mL·kg-1腹腔麻醉所有大鼠，待其角膜反射消失后，用剃毛刀将大鼠胸部、腹部毛发剔除，并擦拭干净。使大鼠呈仰卧位，将超声探头放置于大鼠左胸前，由二维超声引导M 型曲线。每个大鼠连续测量3个心动周期的数值，将超声心动图保存起来作为为原始数据，观察并记录LVEDD、LVESD、LVEF、LVFS、室间隔厚度（interventricular septal thickness，IVS)，左室后 壁 厚 度（left ventricular posterior wall thickness，LVPWT)。

1.2.4 Masson染色观察心肌组织形态学改变

心超检测后，开胸取出大鼠心脏，用冰浴生理盐水冲洗，滤纸吸干水分，取左室前壁心肌部分组织浸泡于甲醛溶液中，制成石蜡切片，切片脱蜡至水。用Masson 染色观察心肌组织形态学改变。每个标本选取5 个视野，使用Image-Plus 6.0 图像分析系统分析心肌胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF）。

1.2.4 免疫组化观察ColI、ColIII

石蜡切片脱蜡至水，抗原修复及封闭后，滴加ColI、ColIII 的I 抗50μl，37℃60 min（浓度为1:200），然后滴加生物素化II 抗，37℃30 min。经显色，复染，脱水、透明后封片，用OlyVIA 软件分析图像。每张切片选取不同5 个视野，观察染色情况，之后运用ImagePro Plus 6.0软件计算各片阳性表达占总面积的百分比，并进行组间比较。

1.2.5 蛋白芯片检测TGF-β1通路相关蛋白表达

取适量-80°保存大鼠心尖部组织，采用Full Moon公司芯片（CSP100 plus），实验步骤按照Full Moon公司的标准操作进行，检测由上海华盈生物医药科技有限公司完成。

1.2.6 Western blot法检测TGF-β1、Smad2蛋白表达

取适量-80°保存的大鼠心尖部组织，标本预处理后予以匀浆、裂解，离心，计算样品总蛋白浓度。配置10%分离胶，5%浓缩胶，然后电泳，结束后将目的蛋白转移至膜，于5%BSA 室温封闭2 h，洗模后加入封闭液稀释的TGF-β 抗体（1:1 000）和Smad2 抗体（1:1 000），孵育过夜，洗膜后再加入稀释的二抗（1:2000），室温孵育后洗膜，上机显影。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 心超

用阿霉素腹腔注射造模后第9 周行心超检测示：与Con 组相比，Dox 组LVEDD、LVESD 明显增加（P＜0.01），EF、FS 明显降低（P＜0.01），提示造模成功。而经药物干预后，与Dox 组比较，扩心方中、高剂量组和阳性药对照Cap 组大鼠LVEDD、LVESD 均有明显降低（P＜0.01），扩心方低剂量组LVEDD 有所降低（P＜0.05），LVESD 无明显统计学差异（P＞0.05）。EF、FS方面，扩心方所有剂量组及卡托普利组大鼠EF、FS 均有明显改善（P＜0.01），其中扩心方低、中、高剂量组呈现出一定的剂量－效应关系，尤以高剂量组为优。IVS、LVPWT 方面，与模型组相比，中药与西药干预皆未有明显改善作用，但在数值上，中药干预组可见随药物浓度增加，数值改善越明显（图1）。

图1 各组实验大鼠心超指标比较

2.2 Masson染色观察心肌组织形态学改变

与Con 组相比，Dox 组大鼠心肌间质可见大量蓝色纤维化组织，心肌细胞排列奈乱，CVF 显著升高（P＜0.01）；与Dox 组相比，KXF-H 组可见少量胶原纤维，CVF 显著降低（P＜0.01），KXF-M 组心肌间质可见部分纤维组织，CVF 较模型组明显减少（P＜0.01）；KXF-L组间质可见稍多心肌纤维组织，CVF 较模型组仍有明显减少（P＜0.01）；卡托普利组接近正常组，肌纤维间隙较正常组稍宽，CVF 较模型组明显减少（P＜0.01）。从CVF 数值可见扩心方治疗随浓度增加，呈现出一定的剂量-效应关系（图2、表1）。

图2 心肌Masson染色（×200倍）

表1 各组实验大鼠CVF结果比较（ ± s，%）

表1 各组实验大鼠CVF结果比较（ ± s，%）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别Con组（n=8）Dox组（n=6）KXF-L组（n=7）KXF-M组（n=6）KXF-H组（n=8）Cap组（n=7）CVF(%)3.44±0.40 12.83±1.39**8.21±0.67△△7.97±0.41△△7.20±0.48△△6.53±0.16△△

2.3 免疫组化法观察ColI、ColIII

与Con 组相比，Dox 组ColI、ColIIII 表达明显增多，并大片分布于细胞外基质（P＜0.01）。经药物干预后，扩心方所有剂量组ColIIII 表达均明显减少，间质纤维组织增生，胶原增生较模型组明显改善（P＜0.01），扩心方中、高剂量组及卡托普利组ColI 表达明显减少（P＜0.01）、低剂量组有改善（P＜0.05），从数值可见扩心方治疗随浓度增加，呈现出一定的剂量－效应关系（图3、图4、表2）。

表2 各组实验大鼠Col、ColIII含量结果比较（ ± s，%）

表2 各组实验大鼠Col、ColIII含量结果比较（ ± s，%）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别Con组（n=8）Dox组（n=6）KXF-L组（n=7）KXF-M组（n=6）KXF-H组（n=8）Cap组（n=7）ColI 3.8±0.21 18.03±1.67**13.81±0.51△△12.29±1.45△△8.17±0.86△△9.53±0.16△△ColIII 6.71±0.43 26.89±2.77**23.32±1.68△20.33±1.53△△14.31±1.34△△17.29±2.76△△

图3 心肌组织ColI免疫组化（×200倍）

图4 心肌组织ColIII免疫组化（×200倍）

2.4 CSP100 plus蛋白芯片

蛋白芯片TGF-β1 通路中共检测了9 种蛋白，包括：p44/42丝裂原活化蛋白激酶、致癌转录因子c-Myc（Myc）、蛋白磷酸酶2A-α（PP2A-α）、p70 核糖体蛋白S6 激 酶（P70S6K）、Smad1、Smad2、Smad3、TGFBR1、TGFBR2，后2 者为TGF-β1 的受体。在外界刺激下，TGF-β1被激活后与TGFBR2结合形成复合物，随后该复合物再与TGFBR1 结合，激活其下游的Smads 蛋白，发挥生物学作用[9-10]。

蛋白芯片显示经Dox 造模后，与Con 组相比，TGF-β 信号传导通路中有3 种蛋白表达上调，分别为PP2A-alpha（上调1.42 倍）、Smad2（1.5 倍）、TGFBR2（1.44倍）。而经扩心方药物干预后，与Dox组相比，治疗组中此3 种蛋白中有2 种蛋白含量有相应下降，分别为Smad2（下调0.81 倍）、TGFBR2 表达下降（0.77倍），且差异有统计学意义（P＜0.05）（表3、图5）。

图5 3组实验动物CSP100 plus蛋白芯片中Smad2、TGF-β1图像

表3 3组实验动物CSP100 plus蛋白芯片中Smad2、TGFBR2表达水平（ ±s)

表3 3组实验动物CSP100 plus蛋白芯片中Smad2、TGFBR2表达水平（ ±s)

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别Con组Dox组KXF-H组Smad2 1565.2±65.65 1907.6±57.24**1768.17±136.60 TGFBR2 2382.75±124.84 3942.50±644.53**3183.80±168.48△△

2.5 Western blot结果

与Con 组相比，Dox 组TGF-β1 以及Smad2 蛋白表达均明显升高（P＜0.01）。与Dox 组相比，扩心方所有剂量组TGF-β1 表达明显减少（P＜0.01），且改善程度呈现出一定的剂量－效应关系。而扩心方低、中高剂量组与Dox 组相比，Smad2 蛋白未有明显降低，高剂量中药组及卡托普利组中的Smad2 蛋白则明显降低（P＜0.01）（图6）。

图6 各组TGF-β1、Smad2蛋白表达比较

3 讨论

当心脏承受的压力或容量负荷过重时，为了应对这一变化，心肌在形态、大小以及功能上发生结构适应性反应，称之为心肌重塑[11，12]。心肌纤维化是引起心肌重塑的重要病理过程，当心脏受到病理因素刺激时细胞外基质中的胶原过度沉积会导致间质增生，炎性细胞浸润，肌纤维排列紊乱、断裂，从而导致心肌纤维化。细胞外基质成分的改变通常包含成纤维细胞合成和胶原蛋白合成增加，而当胶原蛋白含量增多时，伴随而来的是胶原纤维网的过度形成，此时心肌细胞会被这种网状结构所包围，致使心肌细胞舒缩功能障碍，从而影响心功能。而随着心肌重塑的发生发展，心腔进行性增大，最终极有可能发展成扩张型心肌病[13-14]。近年来，西医在治疗扩张型心肌病、慢性心衰方面有显著进步的同时，仍有一些矛盾点有待解决，比如不少DCM 患者由于血压低并不能耐受抗心衰、逆转心肌重构治疗（如利尿剂，血管紧张素受体拮抗剂，β 受体阻滞剂等）；纠正心衰使用利尿剂时患者出现口干，出虚汗，燥热，但又需要控制入量等，而中医治疗扩心病有诸多优势，如缓解胸闷心慌、气喘等临床症状；增加西药疗效，降低其副作用；改善患者心功能及提高生存率等[6,15-16]。因此探讨扩张型心肌病中医药防治作用机制，有着重要的现实意义。

中医学中没有关于“扩张型心肌病”的直接记载，大多数医家将其归为“心胀”“心痹”“心水”等范畴。扩心方为我院用于治疗扩张型心肌病的协定方之一，课题组前期临床研究提示扩心方可显著改善扩心病患者心功能及临床症状，提高患者生活质量，机制可能与改善心肌重塑，减少心肌纤维化相关，但目前尚缺乏进一步证据[6]。我院终身教授周端认为扩张型心肌病基本病机为“正虚（气阴虚损）邪阻（瘀痰水阻留）”，治以益气养阴、活血化痰利水。在DCM 发生发展过程中，心肌细胞凋亡，炎症因子释放、氧化应激损伤等皆会造成成纤维细胞增生和胶原蛋白沉积，从而导致心肌纤维化，属阴的物质不断的丢失，进而出现气阴两虚之证。扩心方作为益气养阴之方剂，已在临床运用多年，由生黄芪、黄精、丹参、瓜蒌皮、桂枝、黄荆子等组成。其中黄芪、黄精为君药，具有补气、滋阴填精作用；丹参、瓜蒌皮为臣药，具有活血化瘀、理气宽胸之功；同时取桂枝温阳利水之效，黄荆子平喘涤痰之功，以为佐药。诸多现代药理学实验提示扩心方中多味药物皆可抑制心肌纤维化。黄芪作为君药之一，多项临床研究证实其能有效提高DCM 患者EF值、缩小LVEDD、延长步行距离、保护心功能[17]。动物实验证实黄芪能有效改善Dox诱导的心衰大鼠心肌纤维化，同时可降低炎症因子释放[18]。扩心方中的另一君药黄精则可降低异丙肾上腺素腹腔注射所致模型小鼠心肌细胞间黏附分子-1、血管细胞粘附因子-1蛋白表达，从而延缓心肌纤维化[19]。丹参的主要成分丹酚酸A 可以改善高血压心肌肥厚模型大鼠心肌纤维化，其可能的机制为抑制血管紧张素受体和阻断TGF-β1/Smads 信号通路[20]。另外扩心方中多味药物如瓜蒌皮、灵芝、毛冬青等兼具有心脏保护作用[21，22]。

当心脏受到病理因素刺激时会生成大量的I 型与III 型胶原蛋白，形成细胞外基质和纤维沉积，细胞外基质中的胶原过度沉积会导致间质增生，炎性细胞浸润，肌纤维排列紊乱、断裂，导致间质纤维化，从而引起心脏舒缩功能障碍[23,24]。本研究通过Masson 染色观察心肌组织形态学改变发现与Con 组相比，Dox 组大鼠心肌间质可见大量蓝色纤维化组织，心肌细胞排列奈乱，尤其是血管周围明显。而经过药物扩心方干预后，中药各剂量干预组大鼠心肌纤维组织明显减少，排列紊乱改善，其中扩心方治疗组中，随药物浓度增加，呈现出一定的剂量－效应关系。而免疫组化观结果显示发现与Con组相比，Dox组ColI、ColIII表达明显增多，并大片分布于细胞外基质，且形态不规则，排列紊乱，而经扩心方治疗后，ColI、ColIII 表达明显减少，排列也较为整齐。另外我们通过心超评估大鼠心肌舒缩功能发现与Con 相比，Dox 组LVEDD、LVESD 明显增加，IVS 减小，EF、FS 明显降低，DCM 大鼠发生了心脏结构改变以及心功能障碍。而经中药治疗后，扩心方中、高剂量组大鼠LVEDD、LVESD 均有明显降低，EF、FS均有明显提高，且与西药卡托普利组效果相当。扩心方低剂量组LVEDD 有所降低，LVESD 方面无差异，EF、FS有明显改善，数值上随扩心方药物浓度的增加，LVEDD、LVESD、EF、FS 改善程度更佳，说明扩心方对DCM心室重构的改善呈现出一定的剂量-效应关系。

越来越多的研究表明，TGF-β1 介导的信号通路与心肌纤维化的发生发展有着紧密关联。TGF-β1 是一种重要的促纤因子，其可刺激心脏成纤维细胞增生、造成胶原I与胶原III的广泛合成，细胞外基质和纤维过度沉积，从而导致心肌纤维化。在外界刺激下，TGF-β1 被激活并释放，随之与细胞表面活性II 型受体（TβRII）结合，再与I 型受体（TβRI）结合，形成复合物，该复合物作用于R-Smads蛋白C端丝氨酸残基，导致Smad2、Smad3 增加且磷酸化，使TGF-β1/Smad 信号传导通路被激活，进而促进胶原纤维的合成和分泌，导致心肌纤维化[9，10]。中医药治疗疾病具有多靴点、多途经、多环节改善症状的特点，为了进一步研究扩心方改善心肌纤维化的上游机制，我们进行了蛋白芯片检测。蛋白芯片技术能从生理、病理、药理等微观机制方面为阐释中医药理论提供可能。本研究通过蛋白芯片检测发现扩心方在TGF-β1信号通路上有多种蛋白表达增加。与Con 组相比，模型组大鼠中PP2Aalpha（上调1.42 倍）、Smad2（1.5 倍）、TGFBR2（1.44倍）。而经扩心方药物干预后，与Dox 组相比，治疗组中此3 种蛋白中有2 种蛋白含量有相应下降，分别为Smad2（下调0.81 倍）、TGFBR2 表达下降（0.77 倍），且差异有统计学意义（P＜0.05），蛋白芯片研究提示扩心方改善Dox 大鼠心肌纤维化可能与TGF-β1/Smad2 信号通路相关。为了进一步证实，我们进行了Western blot实验，结果显示经过中药扩心方干预后，所有中药剂量组大鼠心肌TGF-β1 表达均有明显下降，且呈现出一定的剂量－效应关系，扩心方高剂量组改善最为明显。而Smad2 蛋白表达上，扩心方高剂量组有明显下降（P＜0.01），因此扩心方能有效降低Dox 诱导的DCM大鼠心肌TGF-β1以及Smad2的表达。

综上，本研究以我院中医临床长期用于扩张型心肌病的有效方药扩心方为研究对象，通过动物实验发现扩心方可改善扩张型心肌病大鼠心肌纤维化，其机制可能与抑制TGF-β1/Smad2 信号通路密切相关。目前扩张型心肌病临床缺少针对性治疗方法，国内外对于扩张型心肌病心肌纤维化研究还在不断进展之中。尽管TGF-β1/Smad2 信号通路是常见的信号转导通路，但在扩张型心肌病心肌纤维化发病机制及中医药防治作用的研究较为少见。本研究将为中医药防治扩张型心肌病心肌纤维化提供实验依据，进一步的深入研究正在进行之中。