基于网络药理学与分子对接技术的石菖蒲治疗癫痫作用机制研究＊

杨 燕，王素芬，何希瑞

（遵义医科大学珠海校区生物工程系 珠海 519041）

癫痫（Epilepsy），是一种常见而复杂的神经系统疾病，影响着全球7000多万人。我国癫痫患者已超过1200万，其中约800万是活动性癫痫患者，且每年新增癫痫患者约40万[1]。癫痫已经成为我国仅次于头痛的第2 大神经系统疾病，而尤以儿童与老年患者居多[2]。加之现阶段我国已步入老龄化社会和全面实施两孩政策，使得在未来相当一段时期内，我国癫痫患者的人数有上升趋势。目前，治疗癫痫最主要的手段仍是药物治疗，也有少数患者采用生酮饮食或外科手术干预治疗。但很不幸的是，市场上现有的抗癫痫药物（Antiepileptic drugs，AEDs）仅能控制约70%的患者的癫痫发作，对于30%的癫痫患者的治疗效果不佳或无效[2]。此外，虽然现有的AEDs 具有使用便捷、作用迅速、获得性好等特点而被广泛应用，但长期和不合理使用导致了耐药性和耐受性等问题，使得临床疗效逐渐降低，副作用逐渐增加，严重影响患者的生命安全。因此，癫痫的现有临床治疗药物有限，迫切需要开发更安全、更有效的治疗药物。

在化学合成药物出现之前，药用植物提取物或天然产物被认为是发现抗癫痫药物的可靠来源，常被用于治疗癫痫和控制癫痫相关的症状。特别是，天然产物由于具有多样性的化学结构和广泛的生物活性，为创新药物的发现提供了大量新颖的结构模板，被认为是产生新分子实体的最佳起点之一。因此，近年来，一些具有潜在抗癫痫活性的天然化合物被分离鉴定出来，并用于开发高效低毒的抗癫痫候选药物，具有广泛的应用前景和重要的研究价值。中药是世界上应用最广泛的疾病治疗方法之一，几千年的临床实践积累了许多抗癫痫单味药或和中药配方。据统计，中药中被广泛用于癫痫治疗的代表性药物有：石菖蒲、远志和天麻等[2]。石菖蒲又称为“剑草”，干燥根茎入药，属于天南星科多年生草本植物。其味辛性温，被列为上品，具有豁痰、开窍、活血、理气、散风等功效，经常用于治疗痰迷心窍的中风、癫痫、健忘、神志不清、胃痛等[3]。研究表明，石菖蒲在抗癫痫单味药物中使用频率是较高的，尤其是其在治疗小儿难治性癫痫的方剂中使用的频次最高，且效果最为突出[4]。现代药理学研究表明，石菖蒲的多种提取物在癫痫模型上显示出显著的抗癫痫活性[3-5]，但目前石菖蒲治疗癫痫的活性成分仍未被充分挖掘，作用机理亦未被完全阐明。

近年来，网络药理学方法和分子对接技术为中药活性成分的挖掘、靶点预测及作用机制研究提供了新的视角和思路。因此，本文基于网络药理学、分子对接技术并结合动物实验探讨石菖蒲治疗癫痫的核心有效成分、靶点和信号通路，为石菖蒲防治癫痫的潜在有效成分、作用机制和靶点的深入研究提供理论依据。

1 方法

1.1 石菖蒲有效成分及靶点筛选

通过中药系统药理学数据库（Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http://lsp.nwu.edu.cn/TCMSP.php）收集石菖蒲的潜在有效成分和作用靶点。以“石菖蒲/Acorus tatarinowii”为关键词，并以口服利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、药物相似性（Drug likeness，DL）≥0.18 为筛选条件，收集有效化学成分及靶点信息。使用PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）对有效化学成分名称和CAS 号进行核对。运用Uniprot 数据库（http://www.uniprot.org/）将有效成分作用的相关蛋白靶点名转换为基因名。

1.2 疾病靶点网络获取及筛选

运用GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/），输入“Epilepsy”为关键词进行检索并下载有关的全部基因。将分数值“Score”设置为＞1.5 分进行筛选并获得与癫痫相关的疾病靶点。同时使用Venny 2.1 在线工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）将石菖蒲作用靶点及癫痫作用靶点进行交集。

1.3 药物-活性化合物-靶点-疾病网络构建

运用Cytoscape 3.7.1 软件把检索得到的活性化合物与疾病靶点进行活性化合物-靶点-疾病网络构建，通过绘制的网络图直观展示石菖蒲治疗癫痫的药理作用和机制。

1.4 构建蛋白互作（PPI）网络

运用蛋白-蛋白相互作用关系String 数据库（https://string-db.org），分析石菖蒲活性成分靶点和癫痫疾病靶点之间彼此作用关系，把药物-疾病共同靶点输入String 软件构建蛋白互作网络（Protein protein interaction，PPI），并且运用R（4.0.3）语言对PPI 网络中的靶点蛋白绘制条形图。

1.5 GO和KEGG信号通路富集分析

将获得的石菖蒲-癫痫交集靶点导入Metascape数据库（http://metascape.org/）进行基因本体（Gene ontology，GO）生物学功能分析和京都基因与基因组百科 全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析。以P＜0.01作为筛选条件，选取排名前10 的GO 分析和排名前15 的KEGG 分析结果进行绘图，最终结果分别以条形图和气泡图的形式呈现。

1.6 分子对接

选取成分-靶点-疾病网络中Degree 值排名靠前的石菖蒲有效成分和PPI网络中Degree值排名靠前或癫痫治疗较关键的靶点进行分子对接。采用RCSB PDB 数据库（https://www.rcsb.org）提取对应靶点基因的3D 分子结构pdb 格式。采用PyMOL 软件把得到的靶点分子去水并提取分子配体。采用AutoDock 将分子加氢保存pdbqt 格式文件。运用PubChem 数据库把药物活性成分3D 结构保存为SDF 格式再使用PyMoL软件把SDF转换为pdb文件。然后将主要有效成分的分子结构文档使用AutoDock Tools 1.5.6 软件转换为pdbqt 格式，采用Aotudock-vian 软件将分子和配体进行对接。并对结构的结合能选为最佳。通过ZINC 数据库获取临床常用抗癫痫药卡马西平（Carbamazepine，ZINC4785）为对照药物。

1.7 采用PTZ 诱导的癫痫发作模型评价潜在有效成分的抗癫痫活性

本研究采用皮下注射戊四唑（Pentylentetrazol，PTZ，85 mg·kg-1，批号：P6500-25G）诱导KM 小鼠阵挛性强直性发作模型评价潜在有效成分的抗癫痫活性。研究用到的KM 小鼠购自百试通（SCXK（粤）2020-0051）；石菖蒲药材（批号：200301-1）购自北京同仁堂，其他药物或化合物等购自百灵威科技或爱采购。卡马西平、桉脂素及山奈酚的批号分别为1901101、526-06-7 和60010。实验时取健康小鼠42 只，按体重随机分为7组（6只/组），分别为模型对照组（生理盐水组）、阳性药卡马西平组、石菖蒲水提取液组、桉脂素及山奈酚组。各受试药物均用含0.1%吐温80 的生理盐水溶解。采用双盲法给药，在腹腔注射给药30 min后，皮下注射85 mg·kg-1的PTZ。然后将各受试小鼠单独放于透明盒内观察，记录小鼠强直性发作（发作持续时间≥5 s）的潜伏期，记录肌阵挛发作、全身性发作及死亡率。数据以均数±标准误（±SEM）表示。模型对照组给予生理盐水（含0.1%吐温80）和PTZ，阳性对照组给予药物卡马西平和PTZ。如果在30 min 的观察期内没有发生强制性发作和死亡，则认为具有抗癫痫活性。

2 结果

2.1 石菖蒲的有效成分及靶点收集

通过TCMSP 数据库检索得到石菖蒲化学成分105 个，并以OB≥30%、DL≥0.18 为筛选条件，获得石菖蒲共4 个有效成分别为8-异戊烯基山奈酚、山奈酚、桉脂素和环阿屯醇。化合物具体信息如表1所示。运用TCMSP 数据库分析平台，把检索得到的活性化合物靶点导入，使用Uniprot 数据库将石菖蒲作用的靶点转换为对应的Gene symbol，去除重复靶点基因得到76个靶点。

表1 石菖蒲抗癫痫的潜在有效成分

2.2 疾病靶点网络获取及筛选

使用GeneCards 数据库，输入“Epilepsy”为关键词进行检索并下载有关的全部基因。将分数值“Score”设置为＞1.5 分进行筛选并获取与癫痫相关的疾病靶点共3685 个。然后，使用Venny 2.1 在线平台将石菖蒲作用靶点与癫痫作用靶点导入软件，进行药物-疾病对应靶点交集，得到41个交互靶点（图1）。

图1 药物-疾病靶点韦恩图

2.3 药物-活性化合物-靶点-疾病网络构建

运用Cytoscape3.7.1软件进行构建网络关系图（图2）。从图中可以直观的展示活性成分与癫痫靶标之间的相互关系。其中黄色圆形表示石菖蒲，绿色菱形表示有效成分，粉色六边形表示石菖蒲和癫痫疾病共同靶点，紫色正方形代表癫痫。每一条边意味着药物-有效化合物、有效化合物-靶点、靶点-疾病之间的彼此相互作用关系。可见，石菖蒲是通过作用于多个不同靶点产生互作关系，实现网络调控效应，进而引起复杂的调节关系，从而发挥治疗癫痫的作用。但是，根据“药物-活性化合物-靶点-疾病”网络图发现环阿屯醇并未与癫痫相关的靶标产生互作关系，因此该成分的抗癫痫作用有待进一步的实验验证。

图2 药物-活性化合物-靶点-疾病网络图

2.4 PPI网络的构建

将石菖蒲-癫痫疾病得到的41 个交集靶点导入String 数据库，物种设为Homo sapiens，构建靶点蛋白作用关系图（图3）。网络显示，石菖蒲与癫痫潜在靶标蛋白相互关联并彼此调节。将得到String_interactions.tsv 文件导入R3.6.1 中计算基因出现连接节点的数目，并绘制条形图（图4），结果表明蛋白激酶B α2（Protein kinase B α，AKT1）等潜在靶点在网络中相互作用的参与度很高。此外，CASP3、TNF、人前列腺素内过氧化物合酶2（Prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、MAPK14、MAPK8、ESR1、HMOX1、NOS3、PPARG、GABRA、VCAM1、ICAM1、STAT1、CYP3A4、GSK3B 和CYP1A1 等也参与了互作调节。

图3 石菖蒲治疗癫痫疾病靶点PPI 网络

图4 PPI 网络靶点蛋白Degree 条形图

2.5 关键靶点生物功能和通路分析

2.5.1 GO富集分析

将石菖蒲和癫痫疾病的41 个共同靶点导入Metascape 数据库，其中系统根据P＜0.01 进行筛选，共得到生物学过程（Bioprocess,BP）条目10 个，细胞成分（cellular components, CC）条 目9 个，分 子 功 能（Molecular function,MF）条目10 个（图5）。GO 分析结果表明，石菖蒲参与的生物学过程主要包括：血液循环、对无机物的反应、生殖结构发育、细胞对有机环状化合物和有毒物质的反应、外在凋亡信号通路、神经递质水平调控、活性氧代谢过程、对异源生物刺激的反应等；细胞成分主要包括：膜筏、枝晶膜、离子通道、细胞质核周区域、细胞器外膜、细胞间隙连接和神经细胞体等；分子功能主要是对神经递质受体活性、核受体活性、雌激素2-羟化酶活性、蛋白磷酸酶磷酸化、离子通道活性、激素受体、蛋白激酶活性和钙调蛋白的调节等。

图5 GO 富集分析结果

2.5.2 KEGG通路富集分析

将石菖蒲治疗癫痫的41 个共同靶点导入Metascape 据库，以P＜0.01 筛选，用微生信绘制气泡图，共得到14条KEGG 通路条目。从结果可见（图6），主要途径涉及晚期糖基化产物及其受体（Advanced glycation end products-the receptor of advanced glycation endproducts，AGE-RAGE）信号通路、c型凝集素受体（C-type lectins，CLR）信号通路、环磷酸鸟苷酸-环磷酸鸟苷酸依赖的蛋白激酶（Guanosine 3',5'-cyclic phosphate-cyclic guanosine monophosphatedependent protein kinase，cGMP-PKG）信号通路、雌激素信号通路、Ca2+信号通路和逆行内源性大麻素信号通路等。将KEGG 富集通路文件和药物-疾病交集靶点导入Cytoscape3.7.1软件构建靶点-通路信号网络图（图7），发现石菖蒲的有效成分通过不同的靶点作用于不同的通路。其中，图中蓝色代表靶点蛋白，红色代表KEGG富集通路，粉色代表石菖蒲有效成分，浅绿色代表石菖蒲。结果表明，石菖蒲可通过多条通路作用于癫痫而发挥其抗癫痫活性。

图6 KEGG 通路富集分析气泡图

图7 靶点-通路信号网络图

2.6 潜在有效成分和靶标的分子对接结果

选取石菖蒲抗癫痫潜在有效成分8-异戊烯基山奈酚、山奈酚和桉脂素与癫痫治疗关键靶标PPARG（PDB ID:3E00）、GABRA2（PDB:6X3T）、ATK1（PDB:1UNQ）、KCNMA1（PDB:6V22）、PTGS2（PDB:5F19）进行分子对接，结果如表2所示。8-异戊烯基山奈酚、山奈酚和桉脂素与分子的结合能均小于-5.0 kcal·mol-1，显示出良好的稳定性，表明石菖蒲的有效成分与癫痫关键靶点具有很好的结合力。特别是这三个潜在有效成分与靶标过氧化物酶体增生激活受体γ（Peroxisome proliferative activated receptor gamma，PPARG）的结合能均小于-7.0 kcal·mol-1，说明石菖蒲抗癫痫潜在有效成分与受体蛋白PPARG 具有较强的结合活性。8-异戊烯基山奈酚与靶标PPARG 结合位点的氨基酸残基HIS-435、CYS-432 及LEU-436 形成氢键。此外，三个潜在有效成分与γ-氨基丁酸A 型受体 亚 单 位α2（γ-aminobutyric acid type A receptor subunit alpha 2,GABRA2）的结合能与阳性药卡马西平接近。对接结果显示，化合物山奈酚与GABRA2 结合位点氨基酸残基GLU-177、ASP-219、ARG-169、ASN-80、HIS-119、GLN-64 形成六条氢键（图8）。此外，阳性药卡马西平及5F19 的配体（ligand-ID:COH）与其他蛋白均显示出较好的结合活性。

图8 潜在有效成分与受体蛋白GABRA2的3D分子对接图

表2 石菖蒲抗癫痫潜在有效成分与靶标的分子对接（kcal·mol-1）

2.7 对PTZ-诱导癫痫小鼠的影响

PTZ是用于初步筛选具有潜在抗惊厥药物的常用工具药。PTZ致小鼠癫痫发作是一种常用且经典的癫痫实验模型。研究表明，其作用主要是通过非竞争性拮抗GABAA受体而发挥作用的。本研究通过前期已经构建的PTZ-诱导的癫痫模型初步评价了石菖蒲水提取物及潜在有效成分的抗癫痫作用。研究发现空白对照组小鼠皮下注射PTZ（85 mg·kg-1）后30 min 内出现肌阵挛（100%）、全身性发作（100%）、强直性发作（100%）和死亡（60%）（图9）。与空白对照组相比，桉脂素和山奈酚在50 mg·kg-1剂量下均能显著延长强制性发作潜伏期（P＜0.01），减少小鼠强直性发作只数，显著降低死亡率，特别是桉脂素给药组未出现小鼠死亡。卡马西平（50 mg·kg-1，i.p.）作为阳性对照药物，对小鼠所有的惊厥行为均有改善作用，并且小鼠死亡率较低（33.3%）。石菖蒲水提取物在200 mg·kg-1时可显著延迟强制性发作潜伏期（P＜0.05），降低强直性发作，降低死亡率（50.0%）。此外，其在100 mg·kg-1剂量下也可以延迟强制性发作潜伏期（P＜0.05），但对阵挛性发作、全身性发作、强制性发作及死亡率的影响不明显。石菖蒲水提取物在50 mg·kg-1剂量下抗癫痫活性较弱。

图9 石菖蒲及潜在有效成分抗PTZ 致小鼠癫痫实验结果

3 讨论

3.1 石菖蒲防治癫痫的意义

癫痫作为一种常见的神经系统疾病，发病机制较为复杂，治疗药物有限，亟待探求新型活性化合物。石菖蒲作为开窍类中药，在几千年的中医临床实践中被证明具有开窍豁痰、醒神益智的功效。多年来，它被广泛用于治疗癫痫，热病神昏，痰厥和健忘等症状[5]。现代研究表明石菖蒲对癫痫具有显著的疗效[2,4-5]，但对其抗癫痫的核心有效成分与作用机制尚未被充分阐明。本研究利用网络药理学和分子对接技术对石菖蒲抗癫痫的有效成分和作用机制进行预测，并构建癫痫动物模型对预测结果进行了初步验证，为石菖蒲的临床应用提供理论依据。

3.2 潜在有效成分分析

在石菖蒲抗癫痫的有效成分发掘方面，本研究基于网络药理学发现石菖蒲抗癫痫的主要有效成分为8-异戊烯基山奈酚、山奈酚、桉脂素和环阿屯醇。但是根据“药物-活性化合物-靶点-疾病”网络图，发现环阿屯醇并未与癫痫相关的靶标产生互作关系。因此，该成分是否对癫痫有效尚待进一步去验证。本文研究发现，化合物8-异戊烯基山奈酚、山奈酚和桉脂素可通过干预癫痫的41 个靶点和14 条相关通路发挥作用。研究表明，8-异戊烯基山奈酚可通过介导炎症基因表达和NF-κB 信号通路干预神经系统疾病的发展[6]。桉脂素在大鼠模型上具有显著的抗惊厥和镇静作用，它的作用机制可能与GABAA和谷氨酸脱羧酶（Glutamic acid decarboxylase，GAD65）表达的上调以及脑神经元的抗凋亡有关[7]。山奈酚在神经退行性疾病中起着非常重要的作用，其作用机制主要是通过增强线粒体对Ca2+的吸收和循环从而显著减轻创伤性脑损伤[8]。

3.3 潜在作用靶标分析

PPI 网 络 结 果 表 明，AKT1、PTGS2、PPARG、GABRA 及丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）等可能是石菖蒲治疗癫痫的重要靶点群。其中AKT1 Degree 值最大，表明其在石菖蒲治疗癫痫靶点群中可能占据主要地位。AKT1 属于蛋白激酶B，对细胞存活和凋亡发挥着主要作用，研究发现AKT1 具有控制神经元凋亡并保护神经元、促进细胞生存、减少缺血脑部神经损伤，改善缺氧情况[9-10]；PTGS2 被认为是癫痫治疗的潜在神经治疗新靶标[11]，而癫痫的发生发展与炎症反应密切相关，炎症介质作为发热触发因子参与了高热惊厥的发生；PPARG 与精神分裂易感性有关，其通过调节氧化应激、炎症反应、BDNF/TrkB 及能量代谢在癫痫发作中发挥保护作用，是治疗癫痫最重要的药物靶标之一[12]；p38α/β 丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK14）是中枢神经系统髓鞘和髓鞘再生的关键调节剂，p38MAPK 抑制剂能抑制大鼠癫痫发病其次还能改善癫痫大鼠的认知能力[13]。

GO 生物富集分析结果显示，石菖蒲主要通过影响核受体[14]、离子通道、激素受体、神经递质受体、雌激素2-羟化酶、蛋白磷酸酶、蛋白激酶及钙调蛋白等发挥药效。其中，核受体如PPAR 与癫痫的关系较为密切，是难治性癫痫治疗的新靶标。离子通道也是癫痫防治较为重要的靶标之一，很多上市药物都是通过影响许多不同的电压和配体激活Ca2+、Na+、Cl-离子通道而发挥抗癫痫作用[15-16]。激素结合受体主要通过类固醇激素影响癫痫发作[17]。神经递质受体γ-氨基丁酸A型受体（γ-aminobutyric acid type A receptor，GABAA）在癫痫的发生发展过程中起重要作用。不仅如此，GABRA1-6 的遗传变异能识别疾病变体从而来改善癫痫综合征[18]。

因此，本研究首先对潜在有效成分和上述靶标进行了分子对接虚拟验证。结果发现，化合物8-异戊烯基山奈酚、山奈酚和桉脂素等化合物与靶标GABRA2、PPARG、ATK1、KCNMA1和PTGS2结合能均小于-5.0 kcal·mol-1，表明这些潜在有效成分与靶标之间存在良好的结合活性，说明这些化合物可能主要是通过这些靶标发挥抗癫痫活性，这为将来的抗癫痫作用机制研究指明了方向。

3.4 主要通路分析

KEGG 富集分析结果显示，石菖蒲主要活性成分可通过14 条代谢通路发挥治疗作用（P＜0.01）。相关的通路主要有AGE-RAGE信号通路、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路、CLR 信号通路、cGMP-PKG信号通路、雌激素信号通路、Ca2+信号通路、逆行内源性大麻素信号通路等发挥治疗癫痫作用。其中，AGE-RAGE 信号通路涉及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶、蛋白激酶C和MAPKs的多个细胞内信号途径的激活，然后引发NF-κB 的活化，促进促炎症细胞因子参与神经病变发生发展[19-21]；卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路是由卡波氏肉瘤在γ-疱疹病毒家族去感染神经元细胞，感染后能够引起神经元细胞的形态改变，促进神经元细胞的增殖能力，并且细胞迁移能力减弱[22，23]；CLR 通路是参与病原体或损伤分子识别和早期应答阶段的经典信号通路，参与了炎症与神经病变的发病进程[24]；cAMP 信号通路主要是通过影响AC-cAMP-PKA 信号传导来调节神经递质的传递[25]；雌激素信号通路是由雌激素水平的降低与神经退行性过程和认知能力下降的发生有关[26]。因此，上述通路与治疗癫痫的潜在靶标互作关系密切，与癫痫疾病的发展密切相关，表明石菖蒲可通过多个靶标多条通路作用于癫痫从而发挥治疗作用。

3.5 在体抗癫痫活性分析

本研究基于网络药理学和分子对接结果发现，GABRA2 基因是石菖蒲潜在有效成分主要的靶基因之一。GABA 是哺乳动物大脑中主要的抑制性神经递质，作用于GABAA受体，后者是配体门控的氯离子通道。PTZ 是一种作用于GABAA受体复合物的非竞争性拮抗剂，其诱导的强直阵挛发作模型被认为是控制肌阵挛和失神发作的药物的经典模型[29]。因此，本研究首先构建了PTZ-致小鼠癫痫模型，评价了石菖蒲水提取物、桉脂素和山奈酚的抗癫痫活性。结果表明，桉脂素和山奈酚在PTZ 诱导的癫痫小鼠模型上具有显著的抗癫痫活性，且能明显降低癫痫小鼠的死亡率。此外，结合分子对接结果和PTZ 诱发癫痫的机理，可以初步说明GABAA受体是桉脂素和山奈酚发挥抗癫痫的作用机制之一，值得进一步的深入研究。

综上所述，本研究首次通过网络药理学方法和分子对接技术，并辅以动物实验验证，从多个角度验证和阐释了中药石菖蒲抗癫痫的核心有效成分和作用机制，发现石菖蒲抗癫痫呈现出多成分、多靶点、多通路的特点，其主要有效成分桉脂素和山奈酚等可通过作用于GABAA、PPARG、AKT1和PTGS2 等靶标而协同影响体内雌激素信号通路、AGE-RAGE、cGMP-PKG和离子通道信号通路等多条代谢通路而抑制癫痫的发作。因此，石菖蒲在防治癫痫疾病方面具有较大的临床价值和研究潜力。后续研究应重点考察潜在有效成分的抗癫痫活性及安全性，并深入探讨作用机制，以期为石菖蒲防治癫痫提供一定的科学依据。