益心舒对缺血型心肌病大鼠心室重构和三磷酸腺苷含量的影响及机制

2022-04-26齐贵彬高建步张永杰王星张明磊王新敏李京倡解莉莉

广东药科大学学报 2022年2期

齐贵彬，高建步，张永杰，王星，张明磊，王新敏，李京倡，解莉莉

（南阳市中心医院心血管内科，河南南阳473009）

心室重构和心肌组织能量代谢异常在缺血型心肌病的发生与发展中具有重要作用[1]。近年来研究发现，缺血型心肌病大鼠模型存在心室重构、心肌组织中三磷酸腺苷（ATP）含量明显降低现象，改善能量代谢类药物能够改善心功能和缺血型心肌病症状[2]。益心舒胶囊是由丹参、人参、五味子、黄芪等组成的复方制剂，具有温阳、活血、化瘀等作用，有助于改善缺血型心肌病的临床症状[3]。本研究通过建立缺血型心肌病大鼠模型，观察益心舒对缺血型心肌病大鼠心室重构和ATP含量的影响，并探讨相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD 大鼠60 只，体质量190～210 g，购于北京斯贝福生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2019‑0010。

1.2 主要药品、试剂

益心舒胶囊购于贵州信邦制药股份有限公司，国药准字Z52020038，规格每粒0.4 g，批号B14000033276；卡维地洛片购于北京巨能制药有限责任公司，国药准字H19991108，规格每片20 mg，线粒体膜电位检测试剂盒JC‑1 购于厦门生光生物科技有限公司，批号CA1310‑100；SDS‑PAGE 凝胶制备试剂盒购于上海尚宝生物有限公司，批号10312；鼠抗人β‑抑制蛋白单克隆抗体，（批号DK1052）、鼠抗人磷酸化p38MAPK 蛋白单克隆抗体，（批号DK8524）、鼠抗人解偶联蛋白2 单克隆抗体单克隆抗体，（批号DK5271）、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG（批号HDK0221），均购于武汉科茵生物科技有限公司。

1.3 主要仪器

Voluson S6彩色超声诊断仪购于美国GE 公司；CMY‑10 型手持式组织匀浆机购于上海测博生物科技有限公司；Eppendorf5418R 高速离心机购于德国艾本德股份公司；PT‑350C 全波长酶标仪购于北京普天新桥技术有限公司。

1.4 方法

1.4.1 缺血型心肌病大鼠模型制备[4]随机选取12只大鼠为正常对照组，另外的大鼠采用左侧冠状动脉前降支结扎术制备缺血型心肌病模型。具体方法如下：术前禁食8 h，按300 mg/kg的剂量腹腔注射10%（φ）水合氯醛麻醉，在胸骨左侧第4和第5肋间隙处开胸，将心脏挤出，在肺动脉圆锥和左心耳交界处距离根部1 mm的位置结扎，将心脏迅速放回胸腔，排出胸腔中气体后缝合。将存活的大鼠常规饲养4周，自由进食、饮水，4周后进行彩色超声诊断仪检查，左室射血分数低于50%为缺血型心肌病造模成功。

1.4.2 分组与给药取36只造模成功的大鼠，随机分为模型组、益心舒组、卡维地洛组，每组12只。正常对照组12只大鼠在冠脉前降支距离根部1 mm 的位置仅穿线不结扎，其余操作与另外3组相同。根据人体给药剂量折合后益心舒组大鼠给药剂量为20 mg/kg，使用0.9%氯化钠溶液配制成质量浓度为0.8 mg/mL的益心舒药液；卡维地洛组大鼠给药剂量为10 mg/kg，使用0.9%（ρ）氯化钠溶液配制成质量浓度为0.5 mg/mL的卡维地洛药液；正常对照组和模型组给予相同体积的蒸馏水。每日灌胃1 次，4 周1 个疗程。

1.4.3 左心室结构和心室重构指标检测使用彩色超声诊断仪进行检测，左心室结构改变情况观察指标包括：左心室后壁厚度、室间隔厚度、左心室舒张末期内径、左心室收缩末期内径，均连续检测3个心动周期，取平均值。心室重构指标包括：左心室质量指数=左心室湿质量/大鼠体质量，右心室质量指数=右心室湿质量/大鼠体质量。

1.3.4 心肌ATP 含量测定取各组大鼠心肌组织适量，使用组织匀浆机处理后，4 ℃12 000 r/min离心10 min，收集上清液，加入96孔板中，70 μL/孔，按试剂盒说明书加入相应试剂，上酶标仪检测，使用考马斯亮蓝法测定每个标本的总蛋白浓度，心肌ATP含量最终以ng/mg prot表示。

1.4.5 心肌线粒体膜电位检测[5]取各组大鼠心肌组织约40 mg，手术剪碎后加入牛胰蛋白酶，进行组织匀浆，采用差速离心法获得线粒体。荧光探针JC‑1 检测线粒体跨膜电势差，操作按试剂盒说明书进行，结果用线粒体膜电位发射率（ER）值表示，计算公式：EK=590 nm荧光强度/527 nm荧光强度。

1.4.6 Western blot 检测取各组大鼠心肌组织适量匀浆，4 ℃12 000 r/min离心10 min，取上清液，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。以100 μg 蛋白上样量进行10% SDS‑PAGE 凝胶电泳后转至聚偏二氟乙烯膜，室温下封闭1 h，洗涤后滴加1∶500 倍稀释的鼠抗人β‑抑制蛋白单克隆抗体，1∶1 000倍稀释的鼠抗人磷酸化p38MAPK 蛋白、鼠抗人解偶联蛋白2 单克隆抗体，以及1∶2 000 倍稀释的鼠抗人GAPDH 单克隆抗体，4 ℃过夜，次日加入1∶2 000 倍稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG，37 ℃反应2 h，增强化学发光法显色后分析β‑抑制蛋白、磷酸化p38MAPK蛋白、鼠抗人解偶联蛋白2的表达水平。

1.5 统计学分析

使用SPSS23.0 统计学分析软件进行数据处理，实验数据以x±s表示，采用方差分析和t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠左心室结构的变化情况

模型组大鼠左心室后壁厚度、室间隔厚度、左心室舒张末期内径明显低于正常对照组，左心室收缩末期内径明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；益心舒组和卡维地洛组大鼠左心室后壁厚度、室间隔厚度、左心室舒张末期内径明显高于模型组，左心室收缩末期内径明显低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；左心室后壁厚度、室间隔厚度、左心室舒张末期内径、左心室收缩末期内径在益心舒组与卡维地洛组大鼠之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组左心室结构相关指标比较Table 1 Comparison of relevant indexes of left ventricular structure in each group(±s,n=12)

与正常对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05。

组别正常对照组模型组益心舒组卡维地洛组剂量/（mg·kg-1）--2 0 10左心室后壁厚度/mm 2.64±0.31 1.52±0.15**1.89±0.20#1.93±0.25#室间隔厚度/mm 2.81±0.29 1.58±0.17**2.06±0.24#2.12±0.27#左心室舒张末期内径/%6.83±0.59 4.46±0.43**5.27±0.51#5.09±0.46#左心室收缩末期内径/%1.18±0.11 2.36±0.24*1.71±0.18#1.79±0.21#

2.2 各组大鼠心室重构指标变化情况

模型组大鼠左心室质量指数、右心室质量指数明显高于正常对照组（P＜0.05或P＜0.01），益心舒组和卡维地洛组大鼠左心室质量指数、右心室质量指数明显低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）；左心室质量指数、右心室质量指数在益心舒组与卡维地洛组大鼠之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠心室重构指标变化情况分析Table 2 Analysis of changes in ventricular remodeling indexes of rats in each group(±s,n=12) w/(mg·g-1)

与正常对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01。

组别正常对照组模型组益心舒组卡维地洛组剂量/（mg·kg-1）--2 0 10左心室质量指数1.62±0.15 3.05±0.24**1.98±0.19##1.91±0.17##右心室质量指数0.50±0.06 0.96±0.11*0.71±0.09#0.68±0.07#

2.3 各组大鼠ATP含量和线粒体膜电位水平比较

模型组大鼠ATP 含量、线粒体膜电位ER 值明显低于正常对照组（P＜0.05或P＜0.01）；益心舒组和卡维地洛组大鼠ATP 含量、线粒体膜电位ER 值明显高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）；ATP 含量、线粒体膜电位ER 值在益心舒组与卡维地洛组间比较差异无统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。见表3。

表3 各组大鼠ATP含量和线粒体膜电位水平比较Table 3 Comparison of ATP content and mitochondrial membrane potential of rats in each group(±s,n=12)

与正常对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01。

组别正常对照组模型组益心舒组卡维地洛组剂量/（mg·kg-1）--2 0 10 ATP含量/（ng·mg-1）10.35±0.47 1.92±0.09**9.86±0.44##10.09±0.41##线粒体膜电位ER值/%4.61±0.34 2.25±0.11*4.53±0.28#4.49±0.25#

2.4 各组大鼠相关蛋白表达水平比较

模型组大鼠β‑抑制蛋白表达水平明显低于正常对照组，磷酸化p38MAPK蛋白、解偶联蛋白2表达水平明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；益心舒组和卡维地洛组大鼠β‑抑制蛋白表达水平明显高于模型组，磷酸化p38MAPK 蛋白、解偶联蛋白2 表达水平明显低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。见表4，图1。

表4 各组大鼠相关蛋白表达水平比较Table 4 Comparison of expression levels of related proteins in rats of each group (±s,n=12)

与正常对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01。

组别正常对照组模型组益心舒组卡维地洛组剂量/（mg·kg-1）--2 0 10 β‑抑制蛋白0.95±0.08 0.52±0.14**0.74±0.16#0.77±0.14#磷酸化p38MAPK蛋白0.21±0.05 0.92±0.11**0.47±0.15##0.41±0.13##解偶联蛋白2 0.16±0.03 0.84±0.08**0.29±0.14##0.23±0.11##

图1 各组大鼠相关蛋白表达的Western blot电泳图Figure 1 Western blot electrophoresis of rat related protein expression in each group

3 讨论

缺血型心肌病是常见的心血管系统疾病，主要由于心肌损伤，心脏长期处于高负荷导致心室供血不足，引发的一系列失代偿反应[6]。在中医理论中将其归属为“胸痹”“怔忡”等范畴，治疗原则以温阳、活血、化瘀、通脉等为主[7]。益心舒胶囊组分包括丹参、人参、五味子、黄芪等，具有温阳、活血、化瘀等作用。已有的药理学研究显示，益心舒胶囊能够改善心肌对缺氧的耐受能力，扩张冠状动脉并增加血流量[8]。β-抑制蛋白家族作为一种信号蛋白参与人体的多种生理过程，包括反式激活、泛素化、去磷酸化等效应[9]。由于β‑抑制蛋白具有多个作用靶点，已成为目前研究热点之一。磷酸化p38MAPK蛋白在人体细胞中广泛分布，在缺氧、辐射、炎症等多种因素的作用下被激活，是β‑抑制蛋白下游的重要靶点[10]。相关研究显示，p38MAPK蛋白被激活与心力衰竭密切相关，可能与诱发心肌细胞凋亡和心室重构有关[11]。

本研究结果显示，益心舒组和卡维地洛组大鼠左心室后壁厚度、室间隔厚度、左心室舒张末期内径明显升高，左心室收缩末期内径、左心室质量指数、右心室质量指数明显降低，且在上述两组间无明显差异，提示益心舒胶囊和卡维地洛能够明显抑制缺血型心肌病大鼠的心室重构。进一步分析发现，益心舒组和卡维地洛组大鼠β‑抑制蛋白高表达，磷酸化p38MAPK 蛋白低表达，可推测益心舒胶囊抑制缺血型心肌病大鼠心室重构的机制可能与调节心肌细胞中β‑抑制蛋白、磷酸化p38MAPK 蛋白表达有关。

心肌能量供应不足导致心脏结构和功能受损参与缺血型心肌病的发生与发展，是心室重构进展的主要因素[12]。线粒体是细胞能量代谢的主要场所，解偶联蛋白2是线粒体内膜两侧的质子转运体，通过改变线粒体的膜电位水平来调节心肌能量代谢[13]。相关研究显示，在缺血型心肌病早期，解偶联蛋白2 能够抑制超氧阴离子分泌和细胞凋亡，稳定细胞钙离子水平[14]；随着缺血型心肌病的进展，解偶联蛋白2表达不断上调，解偶联作用增强，对心肌代谢产生不良影响，造成心肌细胞兴奋和收缩偶联异常，心功能下降[15]。本研究结果显示，模型组大鼠ATP 含量、线粒体膜电位ER 值明显降低；益心舒组和卡维地洛组大鼠ATP 含量、线粒体膜电位ER 值明显升高，且在上述两组间无明显差异，提示缺血型心肌病存在明显的能量代谢障碍，益心舒胶囊能够明显改善缺血型心肌病大鼠的能量代谢，效果与卡维地洛相当。进一步分析显示，益心舒组和卡维地洛组大鼠解偶联蛋白2 低表达，提示益心舒胶囊可通过抑制缺血型心肌病大鼠偶联蛋白2 的过表达，稳定线粒体膜电位，保证氧化磷酸化进行，提高心肌ATP 含量，增强心肌收缩力，改善心功能。本研究为益心舒胶囊的临床应用提供了理论基础。