田黄方对高脂饮食诱导小鼠肾脏损伤的改善作用及机制研究

2022-04-26黄敏仪陈可纯罗朵生贝伟剑杨祎琦郭姣

广东药科大学学报 2022年2期

黄敏仪，陈可纯，罗朵生，贝伟剑，杨祎琦，郭姣

（广东药科大学广东省代谢病中西医结合研究中心/糖脂代谢病教育部重点实验室/广东省代谢性疾病中医药防治重点实验室，广东广州510006）

随着中国社会经济的持续发展，人们的饮食结构发生了很大的改变，高脂肪、高热量的食物摄入比例不断增加，高脂饮食导致的血脂代谢紊乱使过多的脂质堆积在肾脏，从而导致肾损伤[1]。田黄方（THF）为广东药科大学郭姣教授多年的临床验方[2]，由黄连、三七2 味中药组成，具有治疗高脂血症、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化、肾间质纤维化及老年糖脂代谢紊乱等功效[2‑6]。本研究利用高脂饮食诱导的小鼠肾脏损伤模型为载体，探究其对肾脏的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

黄连、三七饮片由广州致信中药饮片有限公司提供（批号：190301、190603），THF 是由黄连与三七饮片通过乙醇提取和大孔树脂富集纯化的方法制备得到的提取物；蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂（美国Roche 公司）；组织蛋白提取液（美国Thermo sci‐entific 公司）；BCA 试剂盒（康为世纪生物科技有限公司）；总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL‑C）、丙二醛（MDA）、乳酸脱氢酶（LDH）和超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（南京建成生物工程研究院）；SDS‑PAGE凝胶快速制备试剂盒（上海雅酶生物科技有限公司）；PVDF 膜（美国im‐mobilon‑PSQ 公司）；一步法TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（碧云天生物技术公司）；TBS缓冲液、PBS缓冲液、SABC 免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；甲醇（天津市致远化学试剂有限公司）；Tween‑20（碧云天生物技术公司）；苏木素‑伊红染液（德国sigma公司）；甘氨酸、Tris Base（上海生工生物工程有限公司）；SDS（Serva 公司）；脱脂奶粉（日本Fujifilm公司）；抗体稀释液（北京中杉金桥生物技术有限公司）；Bax、Bcl2、p‑AKT、GAPDH、β‑actin、Cleaved caspase‑3抗体（美国CST公司）。

1.2 主要仪器

组织破碎仪（美国QIAGEN 公司）；BX53 显微镜（日本Olympus公司）；H2050R‑1低温高速离心机（上海华岩设备有限公司）；1658025 小型垂直电泳仪（美国Bio‑Rad 公司）；10017142ChemiDoc XRS+凝胶成像分析系统（美国Bio‑Rad公司）；SHP‑150型生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；Mithras LB940酶标仪（德国Berthold Technologies公司）。

1.3 实验动物

SPF 级雄性C57BL/6J 小鼠，体质量（18±2）g，购自广东省实验动物中心，饲养于广东药科大学实验动物中心，合格证号：44007200052789。

1.4 高脂诱导小鼠肾脏损伤模型的构建[6]

小鼠购入后自由摄食饮水，按体质量随机分为正常组（Control）、模型组（Model）、田黄方组（THF）。正常组及模型组分别采用正常饮食和高脂饮食喂养5个月后，连续给药THF（10 mL/kg）干预6周，取肾脏组织备检。

1.5 肾脏组织苏木精‑伊红(H&E)染色

将每组相同位置的肾脏组织块放入4%（φ）多聚甲醛中固定后，按照70%（φ）乙醇、75%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇及无水乙醇的浓度梯度进行脱水处理，再用二甲苯进行透明处理，最后置于石蜡中进行包埋处理。将包埋好的组织按照4 μm厚度切片，常规脱蜡，分别置于无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇复水，然后用纯水浸泡5 min 清洗后，进行HE 染色，脱水后，使用中性树胶封片，过夜风干，于光学显微镜下观察组织病理形态。

1.6 肾脏组织中TC、TG、LDL‑C、LDH、SOD 和MDA水平的测定

取小鼠肾脏，加入一定量的4 ℃预冷的PBS，匀浆后于2 500 r/min（4 ℃）离心20 min，收集上清液备用，并测定组织蛋白浓度。根据反应生成的醌类化合物颜色深浅与TC、TG的含量成正比的原理，按照试剂盒说明书检测肾匀浆上清TC、TG 含量。利用直接法‑表面活性剂消除法使吸光度与LDL‑C 的含量成正比的原理，按照试剂盒说明书检测肾匀浆上清LDL‑C 含量。根据反应产生的丙酮酸二硝基苯腙颜色深浅与LDH的含量成正比的原理，按照试剂盒说明书检测肾匀浆上清LDH 含量。根据MDA与硫代巴比妥酸反应形成红色产物的颜色深浅与MDA含量成正比的原理，按照试剂盒说明书检测肾匀浆上清MDA 含量。根据黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应生成超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，最后显色为紫红色，显色物的颜色深浅与SOD 含量成反比的原理，按照试剂盒说明书检测肾匀浆上清SOD活力。

1.7 肾脏组织TUNEL染色

组织固定、脱水、包埋、切片、脱蜡后，使用不含DNase 的蛋白酶K 室温孵育20 min 后，再加入适量TUNEL 检测液，于37 ℃避光孵育1 h，使用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片。荧光显微镜下观察到呈现绿色荧光的细胞，即为凋亡细胞，使用Image J软件进行阳性细胞表达百分比分析。

1.8 肾脏组织中Cleaved caspase‑3的测定

1.8.1 免疫组化法（immunohistochemistry,IHC) 组织固定、脱水、包埋、切片、脱蜡后，进行IHC 染色，染色步骤按SABC 免疫组化试剂盒操作，其中一抗Cleaved caspase‑3 按说明书推荐1∶200 稀释浓度进行实验。最后中性树胶封片，过夜风干。于光学显微镜下观察组织病理形态并拍摄图像，使用Image J软件进行阳性表达定量分析。

1.8.2 蛋白免疫印迹(WB) 法取冻存的肾脏组织，加入一定量含抑制剂的裂解液，匀浆后于12 000 r/min（4 ℃）离心20 min，取上清，按BCA 试剂盒说明书操作，测定组织蛋白含量并定量。每组取等量蛋白上样，采用SDS‑PAGE 分离蛋白，300 mA 恒流转膜2 h 后，使用5%脱脂牛奶常温封闭2 h，洗膜后，分别加入一抗Cleaved caspase‑3（1∶1 000）、GAP‐DH（1∶1 000），4 ℃孵育过夜。次日，回收一抗，TBST 洗膜后，分别加入HRP标记的羊抗兔抗体（1∶3 000），常温孵育1.5 h，回收二抗，洗膜后显影。使用Image Lab软件分析条带的蛋白灰度值并分析。

1.9 肾脏组织PI3K、p‑AKT、Bax 和Bcl2 蛋白表达水平的测定

采用WB 法测定肾脏组织中PI3K、p‑AKT、Bax和Bcl2蛋白表达水平。实验步骤同“1.8.2”，其中加入的一抗，包括PI3K（1∶1 000）、p‑AKT（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl2（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）和β‑actin（1∶1 000）；加入的二抗，包括HRP 标记的羊抗兔抗体（1∶3 000）、羊抗鼠抗体（1∶3 000）。使用Image Lab软件对蛋白的灰度值进行分析。1.10 统计学分析

采用GraphPad Prism 8 软件对实验结果进行分析，计量数据以±s表示。采用单因素方差分析法（One‑way ANOVA）进行组间比较，方差齐时，使用LSD‑T检验；若方差不齐，则使用Dunnett’s T3 mul‐tiple comparisons test。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 THF 对高脂诱导的小鼠肾脏损伤的病理形态学的影响

采用H&E染色观察小鼠的肾脏组织病理状况。结果如图1 所示，正常组小鼠肾脏组织结构排列比较整齐，肾小球、肾小管形状比较规则；模型组小鼠肾小球体积明显肿胀增大，球囊壁出现黏连；与模型组相比，THF 组小鼠肾小球与肾小管的病理形态均得到明显改善，包括肾小球体积减小、球囊壁黏连减少等。

图1 THF改善高脂诱导的小鼠肾脏损伤Figure 1 THF improves renal damage in mice induced by high fat diet

2.2 THF对高脂诱导的小鼠肾脏中TC、TG、LDL‑C、LDH、SOD和MDA水平的影响

如表1所示，与正常组相比，模型组小鼠肾脏匀浆中TC、TG、LDL‑C、LDH 和MDA 水平显著升高（P＜0.01 或P＜0.05），SOD 水平显著降低（P＜0.05）；经THF 治疗后，一定程度缓解了肾脏损伤，而且肾脏组织中TC 和LDL‑C 水平也显著降低（P＜0.01 或P＜0.05）。

表1 THF改善高脂诱导的小鼠肾脏脂质与氧化应激指标Table 1 Effect of THF on lipid and oxidative stress indicators in mice induced by high fat diet(±s，n=6)

与正常组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01。

组别Control Model THF TC/（mmol·g prot-1）0.27±0.02 0.65±0.17**0.31±0.10##TG/（mmol·g prot-1）0.72±0.13 1.32±0.45*0.85±0.34 LDL-C/（mmol·g prot-1）0.22±0.10 0.44±0.12*0.20±0.06#LDH/（U·g prot-1）4.42±0.88 10.90±4.64**6.67±2.99 MDA/（nmol·mg prot-1）4.65±1.91 16.69±6.33**13.17±4.50*SOD/（U·mg prot-1）11.91±4.83 3.57±3.09*7.06±5.28

2.3 THF对高脂诱导的小鼠肾脏中Cleaved caspase‑3表达的影响

2.3.1 THF改善高脂诱导的小鼠肾损伤中的Cleaved caspase‑3 的表达 IHC 染色结果如图2A 所示，Cleaved caspase‑3 阳性染色主要分布在胞浆，大量表达在肾小管，肾小球也有少量分布，呈棕黄色。从图2B 可知，与正常组比较，模型组Cleaved caspase‑3 的表达显著升高（P＜0.01），THF 干预后，Cleaved caspase‑3显著减少（P＜0.01）。

2.3.2 THF 对高脂诱导的小鼠肾脏中的Cleaved caspase‑3 蛋白表达的影响如图2C、2D 所示，与正常组相比，高脂诱导的小鼠肾脏中Cleaved caspase‑3蛋白的表达显著升高（P＜0.01），经THF 干预后，Cleaved caspase‑3 蛋白在高脂诱导的小鼠肾脏的表达显著减少（P＜0.01）。

图2 THF下调高脂诱导的小鼠肾脏中Cleaved caspase‑3的表达Figure 2 THF reduces the level of Cleaved caspase‑3 in mice induced by high fat diet

2.4 THF 对高脂诱导的小鼠肾脏中PI3K、p-AKT、Bax和Bcl2蛋白表达的影响

如图3 所示，与正常组相比，模型组中PI3K、p‑AKT、Bcl2 蛋白表达和Bcl2/Bax 比值均显著下调（P＜0.05 或P＜0.01），Bax 蛋白表达显著上调（P＜0.01）；与模型组相比，THF 组小鼠肾脏中PI3K、p‑AKT、Bcl2 和Bcl2/Bax 比值均显著上调（P＜0.05或P＜0.01），并且Bax 蛋白表达显著下降（P＜0.01），提示THF可以抑制PI3K/p‑AKT/凋亡信号通路从而抑制高脂诱导的小鼠肾损伤的发展。

图3 THF 对高脂诱导的小鼠肾脏中PI3K、p‑AKT、Bax 和Bcl2蛋白表达的影响Figure 3 Effect of THF on the protein levels of PI3K，p‑AKT，Bax，and Bcl2 in mice induced by high fat diet

2.5 THF 对高脂诱导的小鼠肾脏组织细胞凋亡的影响

如图4所示，与正常组相比，可见高脂诱导的小鼠肾脏组织中凋亡细胞显著增加（P＜0.01）；与模型组相比，THF 组小鼠肾脏中凋亡细胞显著减少（P＜0.01），提示THF对高脂诱导的小鼠肾脏组织损伤有较好的保护作用。

图4 THF 对高脂诱导的小鼠肾脏组织细胞凋亡的影响（200×）Figure 4 Effects of THF on apoptosis of kidney cells in mice fed with high fat diet

3 讨论

高脂饮食可引起机体脂质代谢紊乱，导致肾脏出现脂毒性，表现为血清肌酐及血清尿素氮水平升高、肾小球滤过率异常、蛋白尿、肾小球肥大和肾小球细胞外基质堆积等异常现象[7]，表明脂质代谢紊乱与肾损伤之间存在密切关系。中医典籍中，《素问·逆调论》：“肾者水脏，主津液”，说明若肾气虚弱，气化失常，则肾对津液调控功能发生紊乱，津聚体内而生痰，体内血脂异常[8‑10]。因此，寻找一种有效治疗高脂导致的肾损伤药物，并明确其作用机制，对临床治疗高脂诱发的肾损伤或其他代谢紊乱疾病具有重要意义。

高脂饮食引发的肾脏损伤的一个主要特点是脂质蓄积，主要表现为肾脏组织中TC、TG和LDL‑C的升高[11‑12]。肾脏脂质蓄积容易压迫肾周组织血管，导致肾脏的线粒体功能障碍；肾脏的线粒体损伤后，脂肪酸氧化效率降低，加剧肾脏脂质蓄积，这使得细胞内的游离脂肪酸及代谢产物过量蓄积，活性氧（ROS）大量产生，导致机体ROS 的生成与清除的动态平衡状态被打破，最终肾脏发生氧化应激[13‑14]。另外，随着慢性炎症的出现，肾脏功能不断下降，同时，炎症因子也进一步加重肾脏的脂质积蓄。炎症通过刺激机体产生趋化因子，从而增加ROS 的释放，导致肾脏出现氧化应激，表现为MDA升高，SOD 降低[15]。氧化应激也影响机体的炎症反应及线粒体损伤，加剧肾脏损伤，导致肾脏损伤标志物LDH[16]表达降低。因此，肾脏的脂质积蓄、炎症反应、线粒体损伤、脂质过氧化与氧化应激相互影响，造成肾脏细胞损伤。

肾脏损伤的氧化应激产生大量的ROS 不仅对细胞具有直接损伤的作用，还可以激活一系列信号通路作为信号分子参与细胞凋亡[17]。关于氧化应激诱导肾脏细胞凋亡的机制[14]，研究较多的是线粒体起始的内源性凋亡途径、Bcl2基因家族的调控、NF‑κB、MAPKs家族的介导和caspase级联反应。

田黄方THF 是郭姣教授应用“调肝启枢化浊”法治疗糖脂代谢性疾病的有效验方，能够使肝气调达，气机通畅，五脏调和，气血津液运化正常，化解祛除痰浊等物质，降低血脂[18‑20]。前期研究表明，田黄方能够降低高脂血症大鼠血浆中的TC、TG、LDL‑C[3]，并通过网络药理学预测其可通过PI3K/AKT 信号通路影响糖脂代谢紊乱[21]。本研究也发现，高脂饮食使小鼠肾脏出现脂质代谢紊乱，TC、TG、LDL‑C 和LDH 含量升高，同时肾脏存在如肾小球体积明显增大及球囊壁出现黏连等肾脏病理变化。机体发生脂质代谢紊乱时，伴随氧化应激的出现，而氧化应激与肾损伤有关[1]。本研究中，模型组的MDA 水平升高，SOD 活力降低，反映肾组织内氧化应激的出现。而THF 一定程度逆转了以上的脂质代谢紊乱状态及提高抗氧化水平，减轻肾损伤。在中药治疗高脂诱导的肾损伤的相关研究中，发现通过上调PI3K/AKT 信号通路，缓解高脂导致的小鼠代谢紊乱状态[22‑23]。肾损伤亦与细胞凋亡有关[24]，其中PI3K/AKT 通路的下游促凋亡蛋白Bax、cas‐pase‑3与抗凋亡蛋白Bcl2参与细胞凋亡的复杂病理生理过程[25‑26]。因此本研究围绕THF 是否可通过PI3K/AKT 信号通路，抑制细胞凋亡，从而减轻高脂导致的肾损伤，进行了相关的机制研究。实验结果显示，与正常组相比，模型组小鼠肾脏组织中PI3K、p‑AKT 的表达下降，Bcl2 蛋白的表达和Bcl2/Bax 的比值降低，Bax、Cleaved caspase‑3 蛋白的表达增加，而THF 可以缓解高脂诱导的肾脏中PI3K、p‑AKT、Bcl2、Bcl2/Bax 的表达下降，抑制Bax、Cleaved cas‐pase‑3 的表达升高，表明THF 保护高脂诱导的肾组织损伤可能与调节PI3K/AKT 信号通路、抑制肾脏细胞凋亡有关。

综上所述，田黄方可有效改善高脂饮食诱导的小鼠肾脏损伤，其机制可能与调节PI3K/AKT 信号通路、抑制细胞凋亡、改善机体氧化应激及脂质代谢紊乱相关，如图5。研究成果将为田黄方在临床治疗由高脂饮食引起的肾损伤提供科学依据。