TPX2对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡的调控能力及作用机制研究

孙静 张峰

目前，肺癌在我国占城市人口恶性肿瘤死亡原因第一位。肺癌是临床最为常见的呼吸系统恶性肿瘤，具有高发病率、高死亡的特点[1]。肺癌主要特点为早期转移、生长迅速、高度侵袭性。但Ⅰ期肺癌术后10年生存率可高达90%左右。肺癌包括很多种类，其中最为常见的是非小细胞肺癌，大约占所有肺癌患者的80%左右，其早期症状为发热、咳嗽、胸疼等[2,3]。临床较为常用的治疗非小细胞肺癌的手段包括放疗、化疗、外科手术等，但临床疗效均不十分理想。TPX2蛋白在癌组织中呈现异常高表达，与癌组织的发展、转移具有密切联系[4-6]。本文研究中调控TPX2蛋白表达，旨在探究TPX2对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡的调控能力及相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人非小细胞肺癌细胞株，购于上海中国科学院细胞库。主要试剂：兔抗大鼠Bak抗体(Invitrogen公司)；大鼠抗小鼠Bcl-2抗体(Dako公司)；兔抗小鼠caspase7抗体(Selleck公司)；抗体TPX2(biolegend公司产品)；BCA蛋白定量试剂盒、苏木素(广州市洁利生物有限公司)；MTT试剂盒(天根生化科技有限公司)；DAB显色试剂、磷酸盐缓冲液、胎牛血清、DMSO(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组:将非小细胞肺癌细胞株在37℃进行培养，在5%二氧化碳CO2饱和湿度细胞培养箱中，细胞培养液为10%胎牛血清。当细胞融入85%左右时进行传代。

1.2.2 TPX2相对表达量检测:免疫组化采用SP法。TPX2上调序列：5’-ACCTTGCCCTACTAAGATT- 3’；TPX2下调序列：5’-AATGTGGCACAGGTTGAGC-3’。待检组织10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡处理。分别使用100%～70%的梯度乙醇水化，柠檬酸盐高温、高压修复抗原。等待降至室温后孵育浓度为1∶100的一抗过夜。次日使用PBST洗涤3次，孵育二抗(通用型)DAB显色，苏木素复染，显微镜下进行观察分为对照组、下调TPX2组合上调TPX2组。重悬处理后分别加入4 μg 0.9%氯化钠溶液、TPX2siRNA、pcDNA3.1-TPX2，电击处理后室温环境下存放120 min，将各组细胞加入6孔、96孔培养板中，置于培养箱内进行培养取出后加入含800 μg/ml G418的培养基再次培养。

1.2.3 细胞增殖:使用MMT检测方法进行检测。将待检细胞接种到96孔板中，每孔板中加入3 000个细胞，100 μl细胞培养液，每组设置5个重复孔，进行孵育48 h。在每孔中添加MTT溶液20 μl，置于37℃、5%CO2培养箱中反应4 h，将孔中的液体吸除干净，每孔中在添加150 μl的二甲基亚砜(DMSO)溶液，孵育振荡反应10 min，用全自动酶标仪检测492 nm处OD值。3次重复实验，取其平均值。

1.2.4 细胞凋亡:使用流式细胞仪进行检测。将待测细胞用磷酸盐缓冲液洗2次，加入5 μl的AnnexinV染液和10 μl的碘化丙啶染液，4℃避光染色30 min，使用流式细胞仪检测凋亡率。

1.2.5 细胞周期分布:用流式细胞仪检测。将培养好的细胞用70%的乙醇溶液固定，4℃保存过夜，离心5 min去除固定液后，使用磷酸盐缓冲液清洗3次。加入浓度为100 μg/ml的RNA酶100 μl，常温保存30 min，加入100 μl碘化丙啶染色液，低温避光染色30 min，使用流式细胞仪检测细胞周期分布。

1.2.6 细胞凋亡相关蛋白:使用Western blot法检测，转染48 h后提取蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。与缓冲液混合100℃煮沸5 min后电泳。在90 V、4℃下靶蛋白转移至NC膜上，转膜时间为90 min，封闭：5%胎牛血清白蛋白，室温孵育60 min。经NC膜放置在1∶900稀释一抗中4℃进行孵育。二抗室温1 h后显色。对细胞凋亡相关蛋白Bak、Bcl-2、caspase3相对表达量进行检测。

2 结果

2.1 3组非小细胞肺癌细胞中TPX2表达 下调TPX2组A549的表达含量高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。上调TPX2组A549表达量低于对照组、下调TPX2组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组非小细胞肺癌细胞中TPX2表达

2.2 3组非小细胞肺癌细胞增殖率比较 下调TPX2组细胞增殖率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；上调TPX2组细胞增殖率低于对照组、下调TPX2组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组非小细胞肺癌增殖率比较

2.3 3组非小细胞肺癌细胞周期分布情况比较 下调TPX2组细胞处于G1期的比例高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；上调TPX2组细胞处于G1期的比例低于对照组、下调TPX2组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 3组非小细胞肺癌细胞周期分布情况比较

2.4 3组非小细胞肺癌细胞凋亡率比较 下调TPX2组细胞凋亡率低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；上调TPX2组细胞凋亡率高于对照组、下调

TPX2 组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 3组非小细胞肺癌细胞凋亡率比较

2.5 3组细胞凋亡相关蛋白Bak、Bcl-2、caspase3相对表达量比较 下调TPX2组细胞Bcl-2、caspase3蛋白相对表达量高于对照组，Bak蛋白相对表达量低于对照组、下调TPX2，Bak蛋白相对表达量高于对照组、下调TPX2组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5，图1。

表5 3组细胞凋亡相关蛋白Bak、Bcl-2、caspase3相对表达量比较

图1 Bak、Bcl-2、caspase3表达WB图；A 对照组；B 下调TPX2组；C 上调TPX2组

3 讨论

近年来，我国肺癌的发病率及死亡率呈逐年上升趋势，严重威胁人类生命健康的常见恶性肿瘤之一。其中非小细胞肺癌在肺癌中占比80%左右，5年内的生存率仅在10%左右。非小细胞肺癌(NSCLC)是一种上皮组织来源的恶性肿瘤[7,8]。主要包括腺癌、鳞癌、大细胞癌、因其生长分裂及扩散转移相对较晚，发病机制不够明确，确诊时患者一般处于中晚期。EGRF络氨酸激酶抑制药的出现使分子靶向治疗进入人们的视野，为非小细胞肺癌的个体化治疗注入了新的生命[9]。各类靶向药物的研究层出不穷，寻找有效地治疗靶点对非小细胞肺癌患者来说至关重要。研究发现，TPX2基因在多种恶性肿瘤中存在高表达[10]。具有组织特异性。通过下调AKT信号通路活性可以阻止TPX2基因的表达。TPX2作为新发现的癌基因，可以称为肿瘤细胞增殖更加确切的指标[11]。

1998年首次在非洲有爪蟾蜍中发现，因Xklp2靶蛋白得名。对相关癌指标具有调控作用。参与多种恶性肿瘤的发生发展。在G1/S期过渡到胞质分裂时显著表达，在有丝分裂S/G2期存在细胞核，在肿瘤中AuroraA是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，属于Aurora激酶家族，与调节中心体及微管功能相关。在细胞的蛋白表达水平中TPX2与Aurora激酶家族具有相似性。其在神经胶质瘤中，表达水平随着肿瘤级别的升高而增加[13,14]。研究发现，TPX2与肿瘤的发生存在密切关系，TPX2基因的表达与AKT信号通路的活性下调有关，在食道癌、胃癌等多种肿瘤中出现高表达，汪博等[15]在研究中表示，TPX2在纺锤体聚集及着丝点微管形成有重要作用。说明TPX2可能作为一个癌基因影响肿瘤的发生发展。本文研究结果显示，下调TPX2组非小细胞肺癌细胞TPX2表达量相对较低，下调TPX2可以降低非小细胞肺癌细胞的相对表达量。

细胞周期分为3个：DNA合成前期(G1)、合成期(S)、合成后期(G2)，S是细胞分裂增殖的重要时期。在S期前将细胞阻滞能够有效的抑制癌细胞的发展。相关研究显示，TPX2能够结合并活化AuroraA，有效地调控A549细胞改变癌细胞的周期分布[16,17]。本文研究结果显示，下调TPX2组非小细胞肺癌细胞在G1期的比例相对较高，说明下调TPX2能够降低非小细胞肺癌细胞的相对表达量，起到改变癌细胞周期分布的作用。

细胞的增殖与凋亡是一个复杂的过程，受细胞内多种因子相互作用。Caspase家族蛋白、Bal-2家族蛋白等在凋亡信号中扮演重要角色。Caspase3在其中发挥凋亡执行作用，活化后形成Cleaved Caspase3，标志着细胞凋亡进入不可逆的阶段[18]。Bcl-2是Bcl-2家族蛋白中抗凋亡蛋白，其水平在升高后可有效抑制细胞凋亡的发生;Bak是促凋亡蛋白[19]。本文研究显示，下调TPX2组在12、24、72 h非小细胞肺癌细胞凋亡率升高。且下调TPX2组细胞Bcl-2、Caspase3蛋白相对表达量低，Bak蛋白相对表达量升高，说明下调TPX2能够抑制非小细胞肺癌细胞表达，通过调控细胞凋亡相关蛋白Bak、Bcl-2、Caspase3相对表达量，起到促进非小细胞肺癌细胞凋亡的作用，达到抑制肿瘤发展的目的。

综上所述，下调TPX2能够降低非小细胞肺癌细

胞表达，通过调控Bak、Bcl-2、Caspase3的表达，达到抑制细胞增殖，阻滞细胞周期分布，促进细胞凋亡的目的。治疗效果显著，为临床靶向治疗非小细胞肺癌提供理论依据。