呼吸道感染患儿EBV-DNA载量及与肝肾功能损伤的关系
2022-04-26崔佳丽张巨平刘秀珍
崔佳丽 张巨平 刘秀珍
爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)主要经由呼吸道传染，入体后，可直接侵犯机体免疫系统而发生免疫反应，并会累及全身若干器官和系统，相应的临床表现也复杂多样，给诊断、治疗造成较大障碍[1]。近年感染EBV的儿童有逐年增多的趋势，且有数据显示<4岁的儿童易感率尤其高[2]。EBV感染后的疾病发生率中，呼吸道疾病最多，研究显示，EBV感染后的肝肾损伤概率也很高，但此种肝肾损伤并无易查的、特异性的临床表现，而易被漏诊、误诊[3,4]。所以，EBV感染后如能尽早检查出肝肾功能是否损伤，对于保护患儿肝肾脏器功能，有效控制疾病，改善患者预后极其重要。丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)是公认的反映机体内肝细胞损伤程度及肝组织炎症变化情况的指标，在临床也是筛查、诊断和鉴别肝脏疾病的敏感、有效指标[2，5,6]；同样，胱抑素 C(CysC)、β2微球蛋白(β2-MG)是目前临床用于评估肾功能适用性较高的参考指标[7,8]。目前，病毒DNA载量检测是对患者体内病毒进行检测的较为先进的方式，因其可较为科兴、直观地反映病毒感染状况[9]。目前有关于EBV-DNA载量与呼吸道感染患儿肝肾功能损害关系的研究较少，因此本研究比较了不同性别、不同年龄组患儿的EBV-DNA阳性率，同时分析EBV-DNA与肝肾功能指标水平的关系，旨在为EBV呼吸道感染患儿肝肾损伤的评估提供参考。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集2016年1月至2020年12月河北省邯郸市中心医院门诊及住院治疗且经临床确诊的175例呼吸道感染儿童，其中男98例，女77例；年龄5个月～10岁，平均年龄(4.21±1.31)岁，<1岁39例，1～3岁41例，4～6岁69例，>6岁26例。其中亦发现肝功能异常46例，肾功能异常37例。根据的EBV-DNA载量水平将所收集患儿分为阳性组(EBV-DNA>5.00E+3,n=117)和阴性组(EBV-DNA≤5.00E+3,n=58)；此外，阳性组依据EBV-DNA载量水平不同分为3个亚组：低载量组(5.00E+3
1.2 纳入标准[10](1)患儿均经我院首诊为EBV感染，中途未转院、未经其他途径治疗；(2)呼吸道感染诊断标准：发热(体温≥38℃)，并伴有咳嗽、咳痰、咽喉疼痛、乏力或全身酸痛等；(3)患儿无其他影响本研究的哮喘、肺结核等肺部疾病及恶性肿瘤；(4)患儿监护人充分了解并自愿参与本研究。
1.3 排除标准 (1)伴哮喘、肺结核等其他对本研究有影响的呼吸系统疾病的患儿；(2)中途转院；(3)近期内有服用影响肝肾功能药物史；(4)近期内应用过免疫抑制剂；(5)患有其他肝肾疾病；(6)患儿监护人不愿意参与本研究。
1.4 收集标本 患儿于入院24 h内采集外周血3 ml，以3 000 r/min，离心10 min后取上清液，放于-30℃冰箱中保存待测。
1.5 EBV-DNA 的提取 采用瑞士罗氏公司生产的cobas z480全自动荧光定量PCR分析仪及其配套试剂检测血清中EBV-DNA载量，血清中加入1 ml Trizol 溶液,抽吸均匀后按照试剂说明书操作。于含有 DNA 的 Trizol 溶液中加入 300 μl 纯乙醇。颠倒混匀，4℃离心 5 min，转速：2 000 r/min。去上清，向剩余的 DNA 沉淀中加入含 0.1mol柠檬酸钠的 10%乙醇1.5 ml，室温下旋转放置 30 min。4℃下离心 5 min，转速：2 000 r/min，去上清，以 0.1 mol柠檬酸钠的 10%乙醇溶液重复洗涤一遍。给样本中加入 75%乙醇溶液 1.5 ml，室温下旋转放置 20 min。后4℃下离心 5 min，转速：2 000 r/min，去上清，室温干燥约30 min。于管中加入 8 mmol氢氧化钠 300 μl，4℃过夜。12 000 r/min离心 10 min，取上清入一新管，加入 30 μl 0.1 mol的 HEPES (Molecular Research Center公司，美国)。取 DNA 2 μl 加入 98 μl 超纯水中，进行分光光度仪检测，以超纯水作为空白对照。配制扩增体系20 μl/份，将上述DNA 25 μl溶液加入反应体系；瞬时离心15 s，震荡混匀10 s，再进行瞬时离心15 s后转移至扩增检测区上机检测。
1.6 生化指标检验 采用日本日立公司生产的7170全自动生化分析仪及其配套试剂检测血清ALT、AST、CysC、β2-MG水平，检测严格遵守试剂盒和仪器操作规程进行。
2 结果
2.1 不同年龄、不同性别患儿EBV-DNA载量水平 男、女患儿EBV-DNA 峰值载量阳性率(31.63% vs 35.06%)比较差异无统计学意义(P>0.05)。不同年龄段(<1岁，1～3岁，4～6岁，>6岁)患儿EBV-DNA峰值载量阳性率(61.54% vs 75.61% vs 79.71% vs 26.92%)比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
表1 不同年龄、性别EBV-DNA 峰值载量比较 例(%)
2.2 EBV-DNA不同载量组间肝肾功能异常情况 EBV-DNA阴性组肝肾功能异常患者的构成比例(3.44%和1.72%)低于低载量组(19.67%和13.11%)、中载量组(48.57%和34.28%)和高载量组(66.66%和66.66%)(P<0.05)；低载量组低于中载量组、高载量组(P<0.05)；中载量组低于高载量组(P<0.05)。见表2。
表2 不同EBV-DNA分组与肝肾功能异常的关系 例(%)
2.3 EBV-DNA不同载量组患儿肝肾功能指标水平比较 阴性组患儿血清ALT、AST、CysC、β2-MG水平低于EBV-DNA低载量组、中载量组、高载量组(P<0.05)；低载量组低于中载量组、高载量组(P<0.05)；中载量组低于高载量组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。
表3 EBV-DNA不同载量患儿肝肾功能相关指标水平比较
2.4 EBV-DNA 载量与肝肾功能指标水平的相关性分析 Pearson相关分析结果显示，EBV-DNA 载量与血清ALT、AST水平呈正相关(r=0.683，P=0.022；r=0.759，P=0.010)，EBV-DNA 载量与血清CysC、β2-MG水平呈正相关(r=0.649，P=0.026；r=0.743，P=0.017)。
3 讨论
EBV感染在一年四季中均会发病，但以晚秋至初春时节较多；该感染可以发生于世界各地，且多呈散发，在小范围内可呈流行状态[8-10]。有研究发现，在发展中国家内，EBV初次感染患者的年龄段以婴幼儿为主,在发达国家则以青少年阶段为主[3,4];另有数据显示，EBV 患者初次感染的年龄段和感染率在不同种族、不同社会阶层及不同家庭间也存在较大差异[4,7]。普通人群对EBV的易感性较高，而其在人群中的血清学检测阳性率有可能达到90%[11]。
本研究中175例感染EB病毒的患儿中男性例数为98例、EBV-DNA阴性为31例，阳性为67例，女性例数77例，阴性27例，阳性50例，各组性别构成均是男性高于女性，但是差异无统计学意义(P>0.05)。而不同年龄阶段患儿阳性率差异有统计学意义(P<0.05)，1～6岁为高发年龄，这与既往研究数据显示我国 EB 病毒感染患者的高发年龄在3～5岁，并且感染率可高达90%[12]一致。
EB病毒大多情况下经由呼吸道传播,到达患儿口咽部后，在其上皮细胞中增殖后释放,侵袭局部淋巴组织中的B细胞后进行感染,而正常情况下，B细胞进入人体血液后会引发全身性的EB 病毒感染症状[13]。EB病毒一般会在宿主细胞内长期潜伏，因它的噬B细胞特性,若此时碰到的受体细胞具有内吞作用时，那么EB病毒就会以这种方式非常容易地进入到被感染细胞中[14]；一旦有细胞被感染，B细胞抗原也会随之改变，然后激活T细胞，将其转化成有细胞毒性的效应T细胞，最终达到引起相应组织损伤的目的。在以往的研究中发现，EBV病毒可以将B细胞、T细胞、NK细胞、单核巨噬细胞等感染,另外EBV编码抗原中的VCA、EBNAs等，也能对T细胞发挥激活的作用[15]。
严格来讲，EB病毒只是一种疱疹病毒,也是一种非嗜肝病毒,其在临床上较易造成儿童肝脏损伤，发生肝功能损伤的患儿主要病理表现为细胞的凋亡[16]。肝功能出现损伤时，表现为肝细胞再生能力减弱,进而会影响患者机体的基础代谢水平和蛋白质合成或降解进程,直接导致肝脏储备功能降低。相关的研究结果显示,EB病毒感染时，可连带促进与机体免疫相关的因子发生增殖反应,导致患者的机体各脏器功能均有损伤[17]。另一方面，EB病毒感染时，亦能促进人体中脂质过氧化反应,出现自由基和活性氧等产物,进一步诱发细胞发生毒性作用,使肝细胞受到损伤,这也是患儿出现肝功能异常的原因之一[15]。ALT 和AST 是临床中公认的检测肝功能损害时的敏感指标，也可以在一定程度上反映肝功能受损的轻重水平。
在本研究中,EBV—DNA阴性组肝肾功能异常患者的构成比例低于低载量组、中载量组和高载量组(P<0.05)；低载量组中肝肾功能异常患者的比例低于中载量组、高载量组(P<0.05)；中载量组中肝肾功能异常患者的比例低于高载量组，差异有统计学意义(P<0.05)。说明了EB病毒感染的患儿确实会有肝功能异常的现象,并与陶小娟等[18-20]研究结果相同。
EB病毒感染所引起的肾脏损伤迄今为止并无确切的流行病学调查，我国有研究指出，EB病毒感染相关性肾损伤的死亡率可达1.7%～15.7%，其中儿童期所出现的急性肾损伤较大可能与EB病毒感染相关[19]。血清CysC为内源性小分子蛋白质，循环血液内CysC几乎完全经肾小球滤过而被清除，大部分被肾小管重吸收和降解，一次可有效反映肾功能损伤和肾小球滤过率变化情况。且血清CysC在细胞内产生速度恒定，各种液体中均存在，检测取样方便快捷。不容易受到其他因素的影响。血清CysC对EB病毒感染儿童肾损伤的有较佳的诊断效果[20]。本研究分别对各组患儿CysC、β2-MG进行检测且与EBV-DNA 的拷贝数进行相关性分析发现，EBV-DNA阳性组患儿肾功能异常比率明显高于阴性组，且DNA高载量组CysC、β2-MG明显高于中载量组、低载量组及阴性组，中载量组高于低载量组及阴性组，低载量组高于阴性组，且差异均有统计学意义,CysC、β2-MG与 EBV-DNA的拷贝数有很高的正相关性，EBV-DNA中、高载量组ALT、AST、CysC、β2-MG均明显升高，提示患儿存在肾功能损伤。
由此可以认为，EBV-DNA等在一定程度上可以反应肝、肾功能的受损程度。有相关文献报道，EBV-DNA病毒还与人体受累器官损害程度及疾病的种类、严重度和病死率呈正相关[21]。因此，EBV-DNA病毒检测可用于评估病情及疗效。
