无创产前检测技术对胎儿染色体拷贝数变异检测的临床意义

翟秀璋，卢 庆，赖春慧，陈丹云，刘孙荣，刘 薇，周元圆△

广西壮族自治区南宁市第二人民医院：1.检验科；2.产科，广西南宁 530031

从1997年LO等[1]确认母体血液中存在胎儿游离DNA(cffDNA)并首次引入无创产前检测技术(NIPT)用于常见染色体非整倍体的检测，到2011年PETERS等[2]首次报道NIPT可用于检测胎儿拷贝数变异(CNV)，NIPT被快速推广应用于临床实践中。从检测最常见的胎儿常染色体21/18/13-三体数目异常，逐渐扩展到性染色体非整倍体47,XXY、45,X的异常以及罕见常染色体三体、性染色体高风险甚至亚显微水平的CNV，NIPT的检测范围越来越广，越来越受到临床医师的青睐[3-4]。NIPT作为一项高准确度近似于产前诊断的筛查技术，具有无创、安全、高效、诊断早等优点，并在国内外临床实践中得到广泛的应用，但作为一项新技术尤其是在检测CNV的临床应用中仍面临诸多问题和挑战。有的学者认为，常规NIPT只能检测大部分片段较大的CNV(>6 Mb)，并且需要了解胎儿分数，认为其还不适合常规的临床应用[5]。而有的学者认为，NIPT对5种常见的微缺失综合征(DiGeorge综合征、Cri du Chat综合征、Wolf-Hirschhorn综合征、Prader-Willi/Angelman综合征、1p36缺失综合征)具有较好的检出效能，应大力推广应用于临床[4,6]。尽管人们对NIPT检测CNV的效能及临床应用持不同态度，但随着NIPT应用检测和信息分析方法不断地优化，NIPT检测胎儿CNV具有了可行性。2019年，我国发表的专家共识明确提出，具备良好产前诊断条件的机构可以将拷贝数变异测序(CNV-Seq)作为胎儿CNV的一线产前诊断技术而应用于临床[7]。近年来，基于高通量测序技术的快速发展，国内外一些研究者致力于利用低深度NIPT对CNV进行检测的研究，效果显著[6,8-9]。本研究采用常规低深度NIPT筛查，探讨NIPT在检测CNV中的应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 2018年1月至2020年8月在本院行NIPT筛查的孕妇共22 998例，选择其中筛查结果提示为CNV的90例孕妇为研究对象。纳入标准：(1)单胎妊娠的孕妇；(2)NIPT检测提示高风险、缺失、重复异常的孕妇。90例孕妇年龄18～48岁、平均(32.0±5.5)岁，孕周12～34周、平均(17.4±3.1)周。本研究经医院医学伦理学委员会审核批准，受试孕妇均知情本研究且签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1产前诊断 90例NIPT检测提示胎儿染色体CNV的孕妇建议行介入性产前诊断，其中有60例孕妇接受胎儿染色体核型分析和CNV-Seq产前诊断；NIPT检测低风险的孕妇在医生指导下继续接受常规产前检查。

1.2.2NIPT检测方法 使用乙二胺四乙酸抗凝管采集孕妇外周血10 mL，冷冻低速离心机(4 ℃，1 600×g)离心15 min，收集血浆立即放入-20 ℃冰箱保存。严格按照核酸提取试剂盒(北京博奥晶典生物技术有限公司)说明书提取DNA，通过晶芯胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(北京博奥晶典生物技术有限公司)，经末端修复、接头连接和缺口修复、PCR扩增、文库定量等，采用博奥BES4000基因测序仪进行测序，测序结果依据《无创产前数据分析管理软件》进行测序数据的分析，判断胎儿患染色体非整倍体异常的风险值。

1.2.3羊膜腔穿刺术 所有接受介入性产前诊断的孕妇均知晓羊膜腔穿刺术风险，并签署穿刺知情同意书，然后进行羊膜腔穿刺胎儿羊水细胞培养，行G显带胎儿染色体核型分析(350条带)、CNV-Seq，CNV-Seq报告的解读参照公共数据库(DECIPHER、DGV、OMIM、ClinVar、ISCA、NCBI、UCSC)。

1.2.4核心家系调查 对NIPT检测和CNV-Seq均为阳性的胎儿，为明确致病基因，给胎儿父母再生育提供指导依据，故抽取胎儿父母外周血提取DNA行CNV-Seq进行核心家系调查。

1.3随访 通过电话、电子病历记录系统进行随访、追踪妊娠结局。

1.4统计学处理 数据采用Excel 2016进行处理。计数资料以例数、率表示。

2 结 果

2.1介入性产前诊断结果 60例接受介入性产前诊断的孕妇中：31例(51.67%)未发现致病性CNV或其他染色体异常；1例仅接受羊水细胞培养、胎儿染色体核型分析未见异常，但未进行CNV-Seq，故未纳入统计分析；28例(46.67%)发现CNV，其中27例(病例2～28)CNV-Seq结果与NIPT检测结果一致，1例(病例1)不一致，包括11例(30.29%)拷贝数重复和17例(60.71%)拷贝数缺失，变异主要涉及3、4、7、8、9、10、13、15、18、20、22号及X染色体，且大多数(11例)变异位于13号和X染色体，见表1。将CNV-Seq鉴定的变异与OMIM、DGV、DECIPHER等数据库进行比对，并根据NIH和ACMG达成的技术标准和最新报告解读，确定了16例致病性CNV(包括Prader-Willi/Angelman综合征、Wolf-Hirschhorn综合征、Cri du Chat综合征、DiGeorge综合征、X连锁鱼鳞病等)，5例可能致病性CNV，5例临床意义不明性CNV，2例可疑致病性/临床意义不明CNV。因检测方法的局限性，经染色体核型分析总共诊断出7例CNV，2例染色体结构异常，其余病例均未见异常。

表1 28例产前诊断异常病例的检测结果及妊娠结局

2.2NIPT对CNV的检测效能 NIPT检测CNV的灵敏度、特异度、阳性预测值(PPV)、阴性预测值分别为77.14%、99.85%、49.23%、99.9%。NIPT对不同片段大小CNV检测效能不同：(1)对CNV-Seq<5 Mb的CNV片段，NIPT检测的PPV、灵敏度、特异度分别为66.67%、55.56%、99.97%；(2)对CNV-Seq 5～<10 Mb的CNV片段，NIPT检测的PPV、灵敏度和特异度分别为50.00%、100.00%、99.97%；(3)对CNV-Seq≥10 Mb的CNV片段，NIPT检测的PPV、灵敏度和特异度分别为35.48%、100.00%、99.91%。

2.3核心家系调查结果 2例(病例1、15)NIPT检测和CNV-Seq均为阳性的胎儿核心家系调查结果见表2。根据测序结果，病例1的NIPT检测与CNV-Seq检测结果不一致，结合其父母CNV-Seq结果，胎儿遗传了其父4q35.2和其母Xq28的重复片段，经调查其父母表型正常，无相关遗传病临床表现，经遗传咨询和结合B超结果，其父母选择继续妊娠并于足月剖腹产，新生儿表型正常。病例15父母双方外周血CNV-Seq检测未发现其他致病性或可疑致病性CNV，结合胎儿NIPT、CNV-Seq结果，证实胎儿CNV是新发突变且为“可疑致病性”，经遗传咨询，于孕28周对胎儿进行引产。

表2 2例NIPT、CNV-Seq结果及胎儿遗传方式

2.4随访妊娠结局 28例产前诊断结果异常的孕妇17例引产，11例顺产；31例产前诊断未见异常的孕妇中，1例胎儿因生长受限、宫内死胎而引产，1例足月顺产儿多趾，其余新生儿表型未见异常。30例未进行产前诊断的孕妇中，4例因胎儿心包积液、心脏畸形等引产，1例出生后新生儿表型U型嘴，1例失访，余24例新生儿表型正常。

3 讨 论

长期以来，NIPT检测的结果基本通过CMA进行确证，最新研究表明，CNV-seq可检测大于100 bp的染色体结构异常和大于10%的非整倍体嵌合，比CMA应用更广泛、检测更灵敏[10]。本研究通过对NIPT提示CNV且接受介入性产前诊断的60例孕妇进行胎儿染色体核型分析和CNV-Seq，发现有46.67%胎儿为CNV，51.67%的胎儿未进一步发现CNV及其他染色体异常；NIPT检测CNV的灵敏度、特异度分别为77.14%、99.85%，与既往报道相似[11-12]。本研究共发现16例致病性CNV、5例可能致病性CNV、5例临床意义不明性CNV和2例可疑致病性/临床意义不明CNV。这些致病性CNV涵盖了临床常见的5种微缺失综合征：DiGeorge综合征、Cri du Chat综合征、Wolf-Hirschhorn综合征、Prader-Willi/Angelman综合征及Xp22.31缺失综合征，这些常见致病性CNV胎儿除了Xp22.31缺失综合征经过产前诊断遗传咨询继续妊娠外，其余均被引产。Xp22.31缺失可导致X连锁鱼鳞病等，是罕见的皮肤病，且男女患病概率不同，研究发现这种病变有可能是良性，患者可选择继续妊娠[13]。上述结果表明，通过非侵入性方法鉴定意义明确的微缺失综合征是可行的，采用NIPT筛查常见的致病性CNV有较好的检出率，其为产前诊断遗传咨询提供了建设性的意见和有效帮助，为预防出生缺陷患儿提供有力的筛查技术[14]。

众所周知，胎儿DNA水平、CNV的片段大小和位置、测序深度以及统计方法是NIPT检测胎儿染色体CNV准确性的关键因素，其中CNV的片段大小是最重要的因素[12]。本研究对CNV片段大小为<5 Mb、5～<10 Mb及≥10 Mb检出的特异度相似，分别为99.97%、99.97%、99.91%，但对CNV片段<5 Mb检出的灵敏度(55.56%)相对较低，而CNV片段≥5 Mb则具有较高的灵敏度(100.00%)，与相关研究基本一致[12,15]，而略高于叶小青等[9]的研究。因此，常规测序深度下，NIPT用于筛查胎儿CNV具有一定的临床应用效能，而对于小片段CNV的检测能力有待进一步研究。

本研究NIPT检测CNV的阳性预测值为49.23%，高于王梓茗等[12]的研究，对CNV片段<5 Mb和5～<10 Mb检测的PPV均高于CNV片段≥10 Mb的PPV，与PEI等[5]的研究结果相似。有研究报道，导致阳性预测值较低的原因，一方面是因现行技术的局限性未能检出小片段的CNV。另一方面是微缺失、微重复综合征在正常人群中的患病率极低，并受其缺失、重复片段大小的影响[9,12,16]。一般认为，造成NIPT假阳性的原因包括染色体CNV、母体细胞中自身CNV、母体恶性肿瘤、限制性胎盘嵌合等，其中母体细胞中携带的自身CNV是造成NIPT检测假阳性最常见原因[17]。cffDNA水平过低、嵌合体、母体染色体CNV或染色体部分缺失等多种因素可能会造成生物学假阴性结果[18]。本研究阳性预测值相对以往研究较高，主要原因是NIPT提示CNV阳性孕妇未能全部接受介入性产前诊断进行确证，致使病例较少。因此，在进行遗传咨询时，医生需要向孕妇详细告知NIPT技术的优势和局限性，NIPT出现假阳性可以通过介入性产前诊断做进一步的诊断，然而出现假阴性常常在超声等影像学检查提示异常或胎儿出生后才发现，因此要重视阴性结果，加强孕期超声检查及随访追踪。

2019年专家共识提出，NIPT筛查出胎儿CNV时，应对胎儿样本及其父母双方外周血标本同时做CNV-Seq确证，有利于确定CNV的来源，从而判断胎儿CNV的致病性[7]。本研究对病例1、15进行核心家系调查：病例1遗传了其父亲4q35.2、母亲Xq28的重复片段，结合其父母正常表型及遗传咨询，其父母选择继续妊娠并于足月剖腹产，新生儿表型正常；病例15父母双方外周血CNV-Seq检测未发现其他致病性或可疑致病性CNV，结合胎儿NIPT、CNV-Seq结果，证实胎儿CNV是新发突变且是“可疑致病性”，经遗传咨询，孕妇终止妊娠。SHI等[19]研究表明核心家系验证对解读胎儿CNV的致病性具有重要意义，为胎儿父母再生育提供正确的指导。

综上所述，NIPT技术用于筛查胎儿CNV是可行的，因现有检测水平的局限性，NIPT阳性结果仍需行介入性产前诊断，阴性结果也需加强超声检查及随访，做好遗传咨询。尽管CNV的NIPT检测技术存在着局限性，但得益于现代分子技术，从而不断优化NIPT的检测效能，提高NIPT检测CNV的阳性预测值。通过开发有效的胎儿来源细胞识别与富集技术以及无偏倚的单细胞全基因组扩增技术和高效的cffDNA富集技术，为限制性胎盘嵌合、母体肿瘤等情况下的NIPT寻找解决方案。