MALDI-TOF MS用于耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌的同源性分析*

张河林，张 敏，赵秀林，赵平森△

1.粤北人民医院检验科，广东韶关 512026；2.广东药科大学临床医学院，广东广州 510030；3.粤北人民医院胃肠外科，广东韶关 512026

阴沟肠杆菌作为条件致病菌，广泛分布于自然界，是人类正常微生物菌群的一部分，常引起下呼吸道、泌尿道、手术部位和中枢神经系统等感染。该菌可产生超广谱β-内酰胺酶或质粒介导的Amp C酶，由于使用三代头孢菌素容易诱导该酶的高表达，所以临床上常常选用碳青霉烯类药物进行治疗[1-2]。随着碳青霉烯类抗菌药物在临床上的广泛使用，耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌(CRECL)检出率不断升高，给临床治疗CRECL感染带来极大困难。而流行病学分析则是监测感染暴发以及控制医院感染的重要手段[3]。目前细菌同源性分析的方法多为基因水平，如脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分型(MLST)等，这些方法分型虽然准确、可靠，但成本高，周转时间长且需要专业的技术人员。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)与上述方法原理不同，不仅能够准确、快速鉴定到属、种，甚至是亚种，而且还具有高通量的特点。目前国内外均有研究报道将MALDI-TOF MS技术应用于多重耐药菌的同源性分析[4-5]，但少见用于CRECL的同源性分析。本研究旨在明确粤北人民医院病房是否存在CRECL的克隆传播，评价MALDI-TOF MS的主成分分析(PCA)和核心图谱(MSP)聚类分析用于CRECL同源性分析的可行性。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集2018年8月至2019年6月从粤北人民医院住院患者中分离的非重复CRECL菌株共10株，编号为YG1～YG10，排除无法进行PFGE分型的YG10,共纳入9株菌株(YG1～YG9)。

1.2仪器与试剂 VITEK 2 Compact(法国梅里埃)全自动微生物分析仪(包括比浊仪)及其配套试剂，Microflex LT(德国布鲁克公司)质谱仪及其配套试剂，药敏纸片(英国Oxoid公司)，CHEF Mapper XA 脉冲场电泳仪(美国Bio-Rad公司)，ChemiDoc MP型凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)，内切酶XbaⅠ体系(日本TaKaRa公司)。

1.3方法

1.3.1鉴定及药物敏感试验(简称药敏试验) 临床分离的阴沟肠杆菌同时采用VITEK 2 Compact生化鉴定和Microflex LT质谱鉴定，药敏试验采用VITEK 2 Compact系统的MIC法(仪器法)和K-B法。结果判读及解释根据CLSI文件第28版M100进行。生化鉴定及药敏的质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922，质谱仪采用布鲁克配套的质控标准品(BTS)。

1.3.2PFGE分析 参照文献[6]对细菌进行同源性分析：取200 μL经培养后的菌液与低熔点胶1∶1包埋，蛋白酶K和内切酶XbaⅠ在37 ℃水浴中酶切3 h；PFGE条件及结果判读标准参考文献[7]。

1.3.3MALDI-TOF MS同源性分析 将9株(编号YG1～YG9)阴沟肠杆菌接种于新鲜的血平板，置于35 ℃、5%CO2培养箱中，持续培养18～24 h，用灭菌牙签挑取单个菌落的少量细菌均匀涂布在96孔金属靶板孔位上，晾干后加1 μL 70%甲酸溶液均匀涂覆在标本上，待晾干后再加1 μL基质溶液均匀涂覆在标本上，晾干后把96孔金属靶板放入质谱仪中上机检测，检测的结果用Biotyper 3.1软件进行同源性分析。

1.4统计学处理 采用Excel 2019软件对数据进行处理。计数资料以率表示。

2 结 果

2.1药敏试验结果 9株阴沟肠杆菌对头孢呋辛、头孢曲松、氨曲南及头孢吡肟全部耐药，同时对哌拉西林/他唑巴坦和头孢哌酮/舒巴坦(SCF)等β-内酰胺酶抑制剂合剂也表现出高度耐药；虽然9株阴沟肠杆菌都对厄他培南全部耐药，但YG4对亚胺培南(IPM)中介，而YG1和YG9却对亚胺培南敏感。9株阴沟肠杆菌对氨基糖苷类抗菌药物阿米卡星(AMK)的耐药率(11.1%)相对最低，AMK具有较好的抗CRECL效果；其次，对喹诺酮类抗菌药物左氧氟沙星(LVX)的耐药率为55.6%，对磺胺类抗菌药物复方磺胺甲噁唑(SXT)的耐药率为66.7%，但对二者的耐药率均超过了50.0%。其中YG2、YG5和YG8的耐药谱一样，具体药敏结果(不同部分)见表1。

表1 9株阴沟肠杆菌的临床分布及部分药敏试验结果

2.2PFGE同源性分析结果 根据PFGE判读标准(相似度100%的为同一型别；≥7个条带有差异被认为在流行病学上无相关性)，9株阴沟肠杆菌之间均存在7条以上的条带有差异，其中YG4和YG5的相似度最高(67%)，其他的相似度都低于50%，因此9株阴沟肠杆菌在流行病学上无相关性，分为9型，见图1。

图1 9株阴沟肠杆菌PFGE图

2.3MALDI-TOF MS同源性分析结果 采用MALDI-TOF MS分析软件MALDI Biotyper 3.1对9株阴沟肠杆菌进行同源性分析，比较9株菌株质谱蛋白峰的数目与质荷比大小(位置)。MSP聚类分析树状图显示，以水平线距离300作为分型标准，最终将9株阴沟肠杆菌分为3型：YG1、YG3、YG6和YG7为A型，YG2、YG4、YG5和YG8为B型，YG9为C型，其中A型中的YG3、YG7及B型中的YG2、YG5的水平线距离均为0，见图2。PCA聚类分析树状图显示：YG1和YG9的水平线距离较近，归为A型；YG2、YG4、YG7和YG8的水平线距离较近，归为B型；YG3、YG5和YG6的水平线距离较近，归为C型，见图3。

图2 9株耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌的MSP聚类分析树状图

图3 9株耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌的PCA聚类分析树状图

3 讨 论

阴沟肠杆菌是一种重要的条件致病菌，随着头孢菌素在临床的广泛使用，阴沟肠杆菌日渐成为引起医院感染的重要病原体。由于临床治疗中碳青霉烯类抗菌药物使用不规范，部分阴沟肠杆菌出现耐药趋势，严重影响临床抗感染工作[8-9]。因此，快速鉴定阴沟肠杆菌，对其进行分型，并掌握其流行病学相关信息，对阴沟肠杆菌感染进行控制和治疗十分重要。

PFGE因为分型指纹图谱图像分辨力强，结果辨识度和重复性好，操作标准化，并且有成熟的分型结果数据库，被国内外分子流行病学者广泛认同，被认为是微生物亚种分类的“金标准”[10-11]，但是由于其对临床工作的指导意义受限，设备要求高，技术操作繁琐，耗时较长等不足，难以在临床实验室推广运用[12]。而MALDI-TOF MS作为一种快速细菌分型的新兴方法，不仅可以鉴定细菌，还可以通过细菌的蛋白质图谱对细菌进行同源性分析，为临床精准防控多重耐药的阴沟肠杆菌提供指导。

本试验以PFGE同源性分型为金标准，通过PFGE分型，9株阴沟肠杆菌被分为9种不同的型，在流行病学上无相关性。MSP、PCA聚类分析结果与PFGE分型结果相差较大，结果显示MSP、PCA聚类分析与PFGE分型基本无关联性。此外，虽然都是质谱分型，但MSP聚类分析与PCA聚类分析的结果也有很大的差别。MSP聚类分析显示：YG3、YG7的水平线距离为0，推断2株为同一克隆菌株的可能性极大；而YG2、YG5的水平线距离也为0，推断2株为另外同一克隆菌株的可能性极大。PCA聚类分析显示：YG3、YG6水平线距离均小于0.5，推断2株可能为同一克隆菌株来源；而YG2和YG7的水平线距离也小于0.5，推断2株可能为另外同一克隆菌株来源。MALID-TOF MS的2种同源性分析将YG3和YG6分到同一型中，而将YG2、YG4和YG8分到另外同一型中，与PFGE分型结果相差较大。分析其可能原因：(1)PFGE是通过细菌的DNA进行同源性分型，稳定性较好，准确度较高，但在本研究中YG10重复2次试验后仍不能产生可供分析的电泳条带，无法进行PFGE分型，可能是CRECL对内切酶XbaⅠ产生了抗性或缺乏相应的酶切位点，文献[13]认为这是因DNA降解所致，但是文献[14]报道在电泳缓冲液中加入了抑制DNA降解的硫脲后仍未产生电泳条带，故具体原因有待进一步研究。(2)MALDI-TOF MS主要是通过检测不同菌株所表现的独特蛋白峰进行同源性分析，培养时间、温度、环境、检测条件等因素均可影响蛋白质的表达及含量[15]，虽然此次分型所用的蛋白质谱图都是鉴定分值在2.3以上的高质量质谱图，但是PC1+PC2方差总和却没有达到80%，这也是导致MALDI-TOF MS分型结果与PFGE分型结果有所差异的原因之一，但是质谱分型可以对那些不能PFGE分型的菌株进行MSP聚类分析或PCA聚类分析，弥补了PFGE分型的不足。因此，在使用MALDI-TOF MS进行同源性分型时，需要严格按照实验要求，在标准条件下进行同源性分析。此外文献[16]报道，使用ClinPro Tools 3.0软件筛选信噪比、变异系数及质量峰信噪比的比值等符合要求的特征峰来提高质谱分型的灵敏度和特异度。

综上所述，本次研究表明粤北人民医院病房不存在CRECL克隆传播，虽然MALDI-TOF MS能够对实验菌株进行快速鉴定，也可成功进行同源性分型，有一定的分辨力，但目前还没有统一的标准化质谱操作流程，尚不能对MSP聚类分析和PCA聚类分析结果下定论。因此，应继续深入研究该技术，探索一个标准化的质谱操作流程，为临床抗感染工作提供一个快速简便的方法。